[發明專利]天然抗菌劑鴨β-防御素2重組蛋白的制備方法

無效

• 申請號: 200910071927.3
• 申請日: 2009-04-30
• 公開（公告）號: CN101538582A
• 公開（公告）日: 2009-09-23
• 發明（設計）人: 馬得瑩;王瑞琴;劉勝旺;廖文燕;韓宗璽
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市哈科專利事務所有限責任公司
• 代理人: 劉 婭

1、一種大然抗菌劑鴨β-防御素2重組蛋白的制備方法，其特征在于：

(1)根據已發表的禽β防御素基因序列設計特異性引物，上游引物：5`-TGGCTCAGCAGATCTGCA-3`，下游引物：5`-CGCAATGGCAATTTATTC-3`；

(2)采用RT-PCR方法從鴨胰腺組織中擴增鴨AvBD2基因并克隆到pMD-T載體上，經序列測定得如下基因序列：

atgaggatcc?tttacctgct?cttctctgtc?cttttcctgg?tgctccaggt?ttctccagga?ttgtctttgc?cccagcggga?catgtttctctgtaggaaag?gctcctgcca?cttcggaaga?tgtcccatcc?acctgatcag?agttggaagc?tgctttgggt?tccgctcctg?ctgcaaatcgccatgggatg?tataa

(3)根據鴨AvBD2基因序列特點，用EcoRI和SalI雙酶切位點將鴨AvBD2基因亞克隆到原核表達載體pGEX-6p-1中，構建重組表達載體pGEX-6p-1-AvBD2，將其轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，Amp+篩選陽性克隆；

(4)含陽性重組質粒的大腸桿菌BL21單個菌落在Amp+LB培養基中37℃振蕩培養，待OD值達到0.3-0.5時加入IPTG、終濃度為0.6mM進行誘導，誘導2-7小時內，每小時分別采1ml菌樣，并分別于4℃、5000轉離心5分鐘，收獲細菌沉淀，在沉淀中加入1/10菌液體積的1×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸5分鐘，冰浴2分鐘，進行SDS-PAGE分析鑒定，取處理過的樣品15ul/孔，進行SDS-PAGE電泳，積層膠濃度為5％，分離膠為12％，電泳后，經考馬斯亮藍染色，甲醇-冰乙酸脫色液脫色，再通過薄層灰度掃描，確定蛋白質的表達量，獲得分子量30kD的特異表達帶，經蛋白質印跡分析，證明為鴨AvBD2特異蛋白，蛋白質的表達量為38％；

(5)經親和層析柱純化回收鴨AvBD2重組蛋白，并在體外測定鴨AvBD2重組蛋白的抗菌作用與理化特性，研究發現鴨AvBD2重組蛋白：1)能抑殺多殺性巴氏桿菌、枯草芽胞桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等菌；2)對溫度和酸堿度有很高的穩定性，在-20～100℃處理30min或pH?3～12條件下處理30min，其殺菌活性不變。