[發明專利]一種用于寒區嗜菌異小桿昆蟲病原線蟲冷凍儲存方法

無效

• 申請號: 200910071751.1
• 申請日: 2009-04-09
• 公開（公告）號: CN101856015A
• 公開（公告）日: 2010-10-13
• 發明（設計）人: 李春杰;許艷麗
• 申請（專利權）人: 中國科學院東北地理與農業生態研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 劉同恩

技術領域

本發明涉及生物冷凍儲存技術領域，具體地說是一種用于寒區嗜菌異小桿(Heterorhabditis?bacteriophora)昆蟲病原線蟲的變溫冷凍儲存方法。

背景技術

眾所周知，昆蟲病原線蟲(Entomopathogenic?nematodes)是20世紀初發展起來的一種很有潛能的生物防治因子，是指體內攜帶具有病原性的共生細菌，能引起昆蟲致病的一類寄生性線蟲。已經成功用于防治蠐螬、蘑菇蠅、小木蠹蛾、荔枝擬木蠹蛾、光肩星天牛和柑橘象鼻蟲等250余種害蟲。正是因為昆蟲病原線蟲具有廣譜、高效且對人畜和環境安全等特點，美國、澳大利亞、德國、新西蘭、加拿大、日本、俄羅斯和荷蘭等40多個國家投入了大量的人力和財力，進行了大量的線蟲基礎理論、田間應用以及產品開發等方面研究，使得昆蟲病原線蟲的應用和繁殖技術得到了飛速發展。昆蟲病原線蟲的儲存是目前昆蟲病原線蟲領域研究的熱點。通常昆蟲病原線蟲采取低溫儲存方式保存，一般在8-14℃下可以存放2-4個月，儲存期短、長途運輸困難、存活率低和致病力弱，從而限制了昆蟲病原線蟲的生產規模和應用面積；液氮可用于保存昆蟲病原線蟲，但批量儲存產品成本高又不方便。目前多數商品化的線蟲不耐低溫，如果把新鮮的線蟲直接放到0℃以下，線蟲會因體細胞內形成冰核使細胞破裂致死。

發明內容

本發明的目的是為了解決傳統的0℃以上的低溫儲存昆蟲病原線蟲存在儲存期短、長途運輸困難、存活率低和致病力弱的問題，提供一種用于寒區嗜菌異小桿屬昆蟲病原線蟲冷凍儲存方法。

一種用于寒區嗜菌異小桿昆蟲病原線蟲冷凍儲存方法具體操作步驟如下：

步驟一、準備儲存介質和儲存袋：儲存介質為蛭石，將蛭石過40-60目篩，去掉碎末，保持通氣性，然后121℃濕熱滅菌25-30min，加水至蛭石含水量為45-60％；儲存袋為80-100目的尼龍網袋，大小為10×20cm，將儲存介質放入儲存袋中；

步驟二、接種：將10℃保存的新繁殖出來的昆蟲病原線蟲(侵染期幼蟲IJs)接種到儲存介質蛭石中；按10^4-5IJs/g蛭石的劑量接種侵染期幼蟲；

步驟三、變溫冷凍儲存：接種后的蛭石放入冰箱，置于4-5℃環境中24h，之后以1℃/10min的速度降溫到-1℃，并在-1℃恒溫3h，然后再以1℃/10min的速度降溫到-4--5℃，并在-4--5℃保存；即完成昆蟲病原線蟲的冷凍儲存；

步驟四、解凍：以1℃/7min的速度升溫至4℃，4℃停留1h后，再置于室溫解凍24h，備用；

步驟五、線蟲的分離：將裝有蛭石的尼龍網袋置于15-25℃水中浸泡，取出尼龍網袋后，浸泡液即為線蟲懸浮液，可用于防治應用。

所述昆蟲病原線蟲為高寒地區土壤中分離、篩選出的嗜菌異小桿昆蟲病原線蟲。

所述冰箱為具有變溫區可調溫的冰箱，可以實現變溫冷凍。

技術效果：本發明方法打破了當前昆蟲病原線蟲生產規模和應用面積的局限性，儲存期達到5-6個月，解凍后線蟲存活率達80％以上，儲存介質中線蟲回收率達90％，對目標害蟲致病力高于低溫儲存前，防治地下害蟲效果達到80％以上。解決了不利長途運輸和0℃以上的長期儲存使線蟲致病力明顯下降的難題，實現了農業生產實踐中害蟲生物防治的良好效果。

具體實施方式：

一種用于寒區嗜菌異小桿昆蟲病原線蟲冷凍儲存方法，對儲存介質接種侵染期線蟲后，將儲存袋置于冰箱中，通過變溫冷凍，得到昆蟲病原線蟲最佳冷凍儲存條件。

本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式，還包括各具體實施方式間的任意組合。

具體實施方式一：本實施方式用于寒區嗜菌異小桿昆蟲病原線蟲冷凍儲存方法的具體操作步驟如下：

步驟一、準備儲存介質和儲存袋：儲存介質為蛭石，將蛭石過40-60目篩，去掉碎末，保持通氣性，然后121℃濕熱滅菌25-30min，加水至蛭石含水量為45-60％；儲存袋為80-100目的尼龍網袋，大小為10×20cm，將儲存介質放入儲存袋中；

步驟二、接種：將10℃保存的新繁殖出來的昆蟲病原線蟲(侵染期幼蟲IJs)接種到儲存介質蛭石中；按10^4-5IJs/g蛭石的劑量接種侵染期幼蟲；

步驟三、變溫冷凍儲存：接種后的蛭石放入冰箱，置于4-5℃環境中24h，之后以1℃/10min的速度降溫到-1℃，并在-1℃恒溫3h，然后再以1℃/10min的速度降溫到-4--5℃，并在-4--5℃保存；即完成昆蟲病原線蟲的冷凍儲存；