[發(fā)明專利]人干擾素α-2b與人胸腺素α1的融合蛋白及其制備

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910071380.7
• 申請(qǐng)日: 2009-02-05
• 公開（公告）號(hào): CN101798350A
• 公開（公告）日: 2010-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李會(huì)成;李鄭武;朱紅杰;冷國慶;陳玉軍;劉艷;趙華南;高晶;王晴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 哈藥集團(tuán)生物工程有限公司
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C07K1/18
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技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種人干擾素α-2b和人胸腺素α1的融合蛋白工程菌的構(gòu)建以及融合蛋白的制備。

背景技術(shù)：

干擾素(IFN)是一種廣譜抗病毒劑，具有抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)的功能。它并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細(xì)胞表面受體作用使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復(fù)制；同時(shí)還可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的活力，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用，并增強(qiáng)抗病毒能力。臨床上用于治療病毒性疾病、腫瘤和多發(fā)性硬皮病等。

人干擾素α有166或165個(gè)氨基酸組成，分子量為19000Da左右，目前已經(jīng)克隆并確定氨基酸序列的人干擾素α亞成員有20種以上。干擾素具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值，對(duì)它的研究開發(fā)非常的深入。

胸腺素α1(thymosin?alphal，Tα1)是從胸腺素組分5(TF5)中分離純化出的，由28個(gè)氨基酸殘基組成的酸性多肽，不含甲硫氨酸、半胱氨酸和芳香族氨基酸，其Mr為3108Da，pI4.2，N端被乙酰化，但其對(duì)活性影響不顯著。在各種抗原或致有絲分裂原激活后，Tα1能夠增加T細(xì)胞IFN，IL-2和IL-3等淋巴因子的分泌，增加T細(xì)胞表面淋巴因子受體的水平；Tα1還能影響NK前體細(xì)胞的募集，使其在暴露于淋巴因子后變得更有細(xì)胞毒性；在活體內(nèi)Tα1能增加ConA激活后的小鼠淋巴細(xì)胞增加分泌IL-2并增加IL-2受體的表達(dá)作用；配伍其他細(xì)胞因子具有抗腫瘤作用。Tα1臨床用途廣泛，已應(yīng)用于治療乙肝、丙肝、癌癥及免疫缺陷等疾病的研究中，是一種針對(duì)T淋巴細(xì)胞的免疫增強(qiáng)劑。Tα1有巨大的醫(yī)學(xué)價(jià)值，可治療一些免疫系統(tǒng)受抑制或破壞的疾病，包括慢性乙肝、丙型肝炎、愛滋病、癌癥等。目前國外化學(xué)合成的Tα1已臨床應(yīng)用，但成本高，價(jià)格昂貴。

Tα1作為一種免疫增強(qiáng)劑，臨床用途廣泛。目前市場出售的Tα1均為全人工合成，成本高、污染環(huán)境。而組織提取又受到材料來源的限制，且產(chǎn)量極低。人干擾素α-2b和胸腺素α1聯(lián)合應(yīng)用：

人干擾素α-2b和胸腺素α1的生物活性相輔相成，干擾素具有良好的抗病毒作用，是目前治療慢性乙型肝炎較為有效的藥物，但近期療效僅為50％左右，且復(fù)發(fā)率較高；胸腺素α1可以促進(jìn)T細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞的分化與成熟，并可促進(jìn)病毒感染細(xì)胞表達(dá)病毒抗原，有利于HBV感染清除。所以干擾素與胸腺素α1的抗病毒作用在理論上有一定的互補(bǔ)性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，二者聯(lián)合應(yīng)用已廣泛證明對(duì)肝炎和腫瘤的治療作用明顯強(qiáng)于兩者的單獨(dú)使用。

雖然已證明人干擾素α-2b和胸腺素α1聯(lián)合應(yīng)用能大大提高包括慢性肝炎、腫瘤等疾病的治療效果，但是由于這兩種藥品要分別生產(chǎn)，用藥成本非常高。另一方面，在治療過程中需分別注射這兩種藥物，不但延長了治療周期，而且大大增加了患者的痛苦。由于這些原因，迫切需要開發(fā)一種能夠兼容人干擾素α-2b和胸腺素α1生物活性的藥物。美國專利US6319691公開了一種胸腺素α1和人干擾素α-2b的融合蛋白，在兩個(gè)蛋白之間增加了一段連接肽，它既具有干擾素α的抗病毒活性，又具有胸腺素α1的免疫學(xué)活性，同時(shí)將生產(chǎn)兩種藥物的工藝簡化為一個(gè)工藝。此專利只是利用本領(lǐng)域人員熟知的方法使用連接肽把兩種蛋白質(zhì)連接起來，并沒有研究干擾素的結(jié)構(gòu)與連接的關(guān)系。另外，2003年9月中國專利03156231.0公開了一種胸腺素α1和人復(fù)和干擾素的融合蛋白，同樣在兩個(gè)蛋白之間加上了一段連接肽，同樣具有二者的活性。

本發(fā)明通過分析干擾素的結(jié)構(gòu)，胸腺素α1連在人干擾素α-2b的C端不需要連接肽，根據(jù)大腸桿菌、酵母、CHO細(xì)胞等表達(dá)系統(tǒng)的密碼子偏嗜性特點(diǎn)，人工合成IFNα-2b-Tα1融合蛋白的多個(gè)基因，使其能夠在大腸桿菌、酵母、CHO細(xì)胞中高效表達(dá)。在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)融合蛋白，大腸桿菌易于培養(yǎng)、擴(kuò)增迅速、周期短、表達(dá)產(chǎn)物純化簡單、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，所獲得的融合蛋白其干擾素比活性仍然在1×10⁸IU/mg。利用本領(lǐng)域人員熟知的技術(shù)，本發(fā)明的融合蛋白不局限于以大腸桿菌為宿主的表達(dá)。

我們把胸腺素α1連在人干擾素α-2b的N端不使用連接肽，人工合成T?α1-IFN?α-2b融合蛋白基因，同樣使其在大腸桿菌里表達(dá)，表現(xiàn)為不能穩(wěn)定的表達(dá)。分析原因是由于干擾素的第一氨基酸是半胱氨酸，如果直接連接到胸腺素α1后，會(huì)影響干擾素的正常折疊，從而影響其穩(wěn)定表達(dá)。