[發明專利]葡萄球菌腸毒素基因型的檢測方法及基因分型的檢測方法

無效

• 申請號: 200910071033.4
• 申請日: 2009-10-29
• 公開（公告）號: CN101760553A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發明（設計）人: 黃金海;劉業兵;李琳;莊世文
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/45;C12R1/445;C12R1/44
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

技術領域

本發明屬于細菌分子檢測領域，特別是涉及一種葡萄球菌腸毒素基因型的檢測方法及基因分型的檢測方法。

背景技術

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)是重要的食源性及醫源性致病菌，在自然界中無處不在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到，而且其營養要求不高，耐鹽性強，在多數種類的食品中均可存活，故食品受其污染的機會很多，如果條件適合，還會大量繁殖并產生足夠劑量的腸毒素，這些毒性物質與食源性葡萄球菌中毒密切相關，是引起人類疾病的主要致病因子。食品安全事故中，首推2000年致使14000多人受感染的“雪印牛奶”事件，就是由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的中毒事件，根據日本衛生部公布的數字，日本在1980-1999這二十年期間，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒共有2525次暴發，包括59964人；據美國CDC報告，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒僅次于大腸埃希菌，居第二位，占細菌性食物中毒的33％，加拿大的發生率更高，占細菌性食物中毒的45％(Panico?M?G，Caporale?V，Agozzino?E.Investigating?on?a?foodborne?outbreak：analysis?of?thecritical?points.Ann?Ig.2006，18(3)：191-197)。在我國，每年因葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒事件也屢見不鮮。

葡萄球菌毒素引起的食物中毒除了最早被人們發現和熟知的五種腸毒素(SEA，SEB，SEC，SED，SEE)和毒性休克綜合癥毒素I(TSST-1)外，近幾年又陸續發現了SEG、SHE、SEI、SEJ、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER、SET、SEU等新的腸毒素，雖然已從基因水平確認了這些新型腸毒素，但關于其毒素蛋白及功能的研究甚少，甚至認為葡萄球菌腸毒素引起食物中毒病例中，95％是由先前發現的SEA-SEE幾種腸毒素造成的。一些國家就其國內葡萄球菌分離株腸毒素基因型的分布作了調查，然而，不同報道的各型食源性葡萄球菌腸毒素所占的比例在各研究中都有所不同。至今為止，對已發現的葡萄球菌腸毒素系統分型鑒定方法仍未見報道。

基因水平的探索導致新的葡萄球菌腸毒素不斷被發現。金黃色葡萄球菌基因組含有多種IS元件、原噬菌體序列和致病基因島等可移動元件，這些可移動元件的轉移是導致金黃色葡萄球菌新腸毒素基因和高致病性毒株的不斷產生的主要原因。葡萄球菌腸毒素基因簇和毒力島等使得某些基因型腸毒素的出現呈現出很高的關聯性。有研究表明，sek和sea毒素多伴生共存于同一菌株中，sek存在于葡萄球菌毒力島SaPI1上，sea是由噬菌體ΦfMu50A攜帶的，而噬菌體ΦfMu50A又整合到毒力島附近，其二者的緊密聯系即可解釋sea與sek的共存。另有研究稱，毒力島SaPIbov上包含基因tsst、sec和sel，也解釋了這三者在同一菌株中同時出現的現象。

目前，針對金黃色葡萄球菌腸毒素的檢測和診斷技術主要有四大類，即基于病毒抗原、抗體反應的免疫學方法和包括病毒分離、病毒抗原和基因組DNA的核酸檢測技術，以及傳統的動物試驗和新興的生物傳感器技術(高濤.食品中金黃色葡萄球菌腸毒素及檢測方法的研究進展[J].福建分析測試，2003，12(2)：36-39.)。PCR技術能在數小時內使靶序列擴增上百萬倍，并可直接進行樣品檢測，以其快速、靈敏、特異性強、操作簡便、重復性好等優點，被廣泛應用于生命科學等各個領域。但是，葡萄球菌腸毒素基因中AT含量較高，不同型腸毒素序列間的相似性也很高，而部分特定毒素基因型間還呈現密切的連鎖關系，這給腸毒素的基因檢測與分型帶來困難。

葡萄球菌是引起食物中毒最普遍的細菌之一，該菌產生的葡萄球菌腸毒素可引起中毒癥狀，造成嘔吐、腹瀉及休克等。葡萄球菌分布的廣泛性、新型腸毒素基因產生的復雜與多樣性、腸毒素強的耐熱特性，使葡萄球菌腸毒素功能與檢測的研究需求變得尤為突出。加強食品原料中葡萄球菌腸毒素檢測與評價，成為食品安全控制的客觀需要。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種葡萄球菌腸毒素基因型的檢測方法。

本發明的另一個目的是提供一種葡萄球菌腸毒素基因分型的檢測方法。

本發明的技術方案概述如下：

一種葡萄球菌腸毒素基因型的檢測方法，由下述步驟組成：

1)樣品處理：

取0.1～0.5ml樣品，10000～12000r/min，離心1～2分鐘；

2)DNA提?。?/p>