[發(fā)明專利]葡萄球菌腸毒素基因型的檢測方法及基因分型的檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910071033.4
• 申請日: 2009-10-29
• 公開（公告）號: CN101760553A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃金海;劉業(yè)兵;李琳;莊世文
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/45;C12R1/445;C12R1/44
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 陸藝

1.一種葡萄球菌腸毒素基因型的檢測方法，其特征是由下述步驟組成：

1)樣品處理：

取0.1～0.5ml樣品，10000～12000r/min，離心1～2分鐘；

2)DNA提取：

棄上清，加入400～700μl滅菌水懸浮沉淀，10000～12000r/min離心30秒～1分鐘；棄上清，加入100～300μl試劑A于35～40℃下作用20～30分鐘，加入試劑B，再于45～55℃下作用20～30分鐘，10000～12000r/min，離心8～10分鐘；取上清并加入等體積的三羥甲基氨基甲烷飽和酚，充分振蕩混勻，10000～12000r/min，離心5～10分鐘；取上清并加入等體積的體積比為25∶24∶1的三羥甲基氨基甲烷飽和酚、氯仿和異戊醇的混合溶液，混勻后，10000～12000r/min，離心8～10分鐘；取上清并加入2～2.5倍體積預(yù)冷至4℃的無水乙醇，混勻，室溫下放置20～30分鐘以沉淀DNA；10000～12000r/min，離心5～10分鐘；去上清，用體積濃度為70～75％乙醇洗滌1～2次，讓乙醇徹底揮發(fā)；將其沉淀溶于10～50μl試劑C中，即為DNA提取液，2～8℃保存?zhèn)溆茫?/p>

其中：試劑A含有三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸鈉、十二烷基硫酸鈉和溶菌酶，它們的濃度分別為10～50mM、10～50mM、2～10mg/ml、10～50μg/ml，余量為滅菌水，三羥甲基氨基甲烷和乙二胺四乙酸鈉的pH均為8.0；試劑B含蛋白酶K，濃度是0.5～1.0mg/ml，余量為滅菌水；試劑C含有RNase?A?10～50μg/ml，三羥甲基氨基甲烷5～20mM，乙二胺四乙酸鈉0.5～2mM，余量為滅菌水，pH為8.0；

3)PCR：

根據(jù)需要檢測的葡萄球菌腸毒素基因型的個(gè)數(shù)，取相同數(shù)量的PCR管，每支PCR管中加入任意一組PCR引物對，所述PCR引物對由引物1和引物2組成，每支PCR管中加入0.5～1.0μl?25μM引物1，0.5～1.0μl?25μM引物2，1～3μlDNA提取液，2.5單位/μl的Taq酶0.5～1.0μl，2.5～5.0μl?10×PCR?buffer，2.0～4.0μl?dNTP，所述dNTP為dTTP、dATP、dCTP、dGTP四種核苷酸的混合物，每種濃度為2.5mM，2.0～4.0μl?25mM?MgCl₂，加滅菌去離子水至50μl；3000～5000r/min離心2～5秒混勻，置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增；反應(yīng)條件為：

①94～96℃預(yù)變性2～5分鐘；

②94～96℃變性30秒～1分鐘；③45～50℃退火40秒～1分鐘；④72℃延伸40秒～1分鐘，②③④共5～10個(gè)循環(huán)；

⑤94～96℃變性30秒～1分鐘；⑥50～55℃退火40秒～1分鐘；⑦72℃延伸40秒～1分鐘，⑤⑥⑦共25～35個(gè)循環(huán)；

最后72℃延伸6～10分鐘；4℃保溫6～10分鐘，得擴(kuò)增樣品；

根據(jù)需要檢測的葡萄球菌腸毒素基因型，從表1中選擇PCR引物對

表1：

4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析：

取5～10μl擴(kuò)增后的樣品，與2～6μl質(zhì)量比為0.25％的溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，在含0.5～1.0μg/ml溴化乙錠的質(zhì)量比為0.8～1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳和顯色，在透射紫外燈下觀察，如果擴(kuò)增的核酸條帶與表2中擴(kuò)增長度一致，則可判斷被檢測的樣品是含有相應(yīng)葡萄球菌腸毒素基因型的陽性樣品；

表2：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種葡萄球菌腸毒素基因型的檢測方法，其特征是所述步驟3)反應(yīng)條件為：①94℃預(yù)變性3分鐘；②94℃變性30秒，③48℃退火40秒，④72℃延伸40秒，②③④共5個(gè)循環(huán)；⑤94℃變性30秒，⑥51℃退火40秒，⑦72℃延伸40秒，⑤⑥⑦共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸6分鐘；4℃保溫6分鐘，得擴(kuò)增樣品。