[發(fā)明專利]一種條件性基因敲除載體的構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910070819.4
• 申請(qǐng)日: 2009-10-16
• 公開（公告）號(hào): CN101693902A
• 公開（公告）日: 2010-04-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹芝南;王璞玥;趙立青;張松;羅維
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85
• 代理公司: 天津佳盟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

【技術(shù)領(lǐng)域】：本發(fā)明涉及生物基因工程領(lǐng)域中的基因敲除技術(shù)，特別是涉及基因敲除載體的構(gòu)建方法，尤其是一種適用于小鼠染色體基因敲除載體的構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】：基因敲除(geneknockout)，是指對(duì)一個(gè)結(jié)構(gòu)已知但功能未知的基因，從分子水平上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，將該基因去除，然后從整體觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，推測相應(yīng)基因的功能。基因敲除除可中止某一基因的表達(dá)外，還包括引入新基因及引入定點(diǎn)突變。既可以是用突變基因或其它基因敲除相應(yīng)的正常基因，也可以用正常基因敲除相應(yīng)的突變基因。

基因敲除是80年代后半期應(yīng)用DNA同源重組原理發(fā)展起來的一門新技術(shù)。

基因敲除的技術(shù)路線如下：

(1)構(gòu)建重組基因敲除載體

(2)用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞核內(nèi)

(3)用選擇培養(yǎng)基篩選已擊中的細(xì)胞

(4)將擊中細(xì)胞轉(zhuǎn)入胚胎使其生長成為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行形態(tài)觀察及

分子生物學(xué)檢測

條件性基因敲除法可定義為將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。它實(shí)際上是在常規(guī)的基因敲除的基礎(chǔ)上，利用重組酶Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組技術(shù)，在對(duì)小鼠基因修飾的時(shí)空范圍上設(shè)置一個(gè)可調(diào)控的“按鈕”，從而使對(duì)小鼠基因組的修飾的范圍和時(shí)間處于一種可控狀態(tài)。具體的講，就是在要敲除的基因兩側(cè)各插入一個(gè)loxp序列。

其中，條件性基因敲除載體的構(gòu)建工作在目前要花費(fèi)大量的時(shí)間和人力成本，敲除載體的構(gòu)建方法也關(guān)系到整個(gè)基因敲除方案的設(shè)計(jì)的難易。

條件性基因敲除載體的最終形式如附圖1所示。

第一、條件性基因敲除載體構(gòu)建的第一種方法(附圖2)

傳統(tǒng)的基因敲除載體構(gòu)建方法是以細(xì)菌體內(nèi)同源重組為基本技術(shù)進(jìn)行的。要用到可進(jìn)行高效體內(nèi)同源重組的工程菌株(如DY380、EL350或EL250)，以及多個(gè)基礎(chǔ)質(zhì)粒(如pL253、pL452、pL451)(附圖3)。基本步驟如下：

1.BAC的抽提及純化

2.電轉(zhuǎn)用感受態(tài)重組菌(如EL350)的制備及電轉(zhuǎn)化BAC到重組菌株

3.構(gòu)建pL253打靶質(zhì)粒

4.套取BAC中的目的片段

5.構(gòu)建pL452打靶質(zhì)粒

6.插入第一個(gè)loxP(兩個(gè)loxp中間夾一個(gè)neo)

7.純化含第一個(gè)loxp的質(zhì)粒

8.菌體內(nèi)表達(dá)cre酶刪除neo，剩下一個(gè)loxp序列

9.構(gòu)建pL451打靶質(zhì)粒

10.插入第二個(gè)loxP(一個(gè)loxp和一個(gè)neo)

11.純化質(zhì)粒

12.測序鑒定最終得到的質(zhì)粒

該方法存在的缺點(diǎn)是：步驟繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長(通常做一個(gè)載體需要兩個(gè)月甚至更長的時(shí)間)，工作量極大。需要的材料較多，重組菌和基本質(zhì)粒一般實(shí)驗(yàn)室難以獲得，所需的儀器設(shè)備較多，如電轉(zhuǎn)化儀、水浴搖床等，并非所有實(shí)驗(yàn)室都有這個(gè)條件，繁瑣的步驟使得該方法具體設(shè)計(jì)變得極其復(fù)雜，并且容易受制于酶切位點(diǎn)，選酶變得非常困難。

第二、條件性基因敲除載體構(gòu)建的第二種方法

由于PCR酶的擴(kuò)增效率和保真性的提高，目前世界上很多實(shí)驗(yàn)室采用PCR的方法來獲取同源臂和要敲除的基因序列(即附圖1中的L、M、R)，用普通的酶切連接法將三個(gè)片段依次連入基本質(zhì)粒(如pEASY-Flirt)中，從而達(dá)到載體構(gòu)建的目的。(附圖4)。步驟如下：

1、分別PCR出L、M、R片段(如附圖1所示)，回收片段；

2、用BamHI酶切基本質(zhì)粒pEASY-Flirt和L片段，并回收；

3、連接，轉(zhuǎn)化普通大腸桿菌感受態(tài)，涂板；

4、挑克隆提質(zhì)粒鑒定；

5、用AscI酶切上已連入L片段的pEASY-Flirt質(zhì)粒R片段，并回收；

6、連接，轉(zhuǎn)化普通大腸桿菌感受態(tài)，涂板；

7、挑克隆提質(zhì)粒鑒定；

8、用SalI酶切已連入L和R片段的pEASY-Flirt和M片段，并回收；

9、連接，轉(zhuǎn)化普通大腸桿菌感受態(tài)，涂板；

挑克隆提質(zhì)粒鑒定；

10、測序鑒定最終得到的質(zhì)粒。

該方法步驟簡單，但是由于方法本身的原因，有些無法克服的缺點(diǎn)，如

1.很難連接長片段的同源臂。由于基因敲除載體是用于基因打靶的，要求同源臂不能太短，一般2K到7K左右，而這種長度的大片段用傳統(tǒng)的酶切連接方法非常困難。