[發(fā)明專利]一種條件性基因敲除載體的構建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910070819.4
• 申請日: 2009-10-16
• 公開（公告）號: CN101693902A
• 公開（公告）日: 2010-04-14
• 發(fā)明（設計）人: 尹芝南;王璞玥;趙立青;張松;羅維
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

1.?一種條件性基因敲除載體的構建方法，其特征在于該方法包括如下步驟：

第1、設計引物：按常規(guī)設計左右同源片段L和R以及要敲除的序列M的引物，并在引物的5’端加入如下序列：

L上游引物加入TAGCGGCCGCGGATCC

L下游引物加入ACGAAGTTATGGATCC

M上游引物加入TAGGAACTTCGTCGAC

M下游引物加入AAATGACGTGGTCGAC

R上游引物加入CGAAGTTATGGCGCGCC

R下游引物加入TGTTTAAACGGCGCGCC???；

第2、PCR左右同源片段L、R和要敲除的序列M，回收片段；

第3、BamHI酶切基本質粒，回收；

第4、10微升體系中加入體外重組酶1微升，buffer2微升，載體和片段L按試劑說明書比例加入，水補齊；體系放置于37℃30min，50℃30min；之后加入40微升pH=8.0的TE，混勻，從中取5微升轉化感受態(tài)細胞，轉化感受態(tài)，然后加入LB液體培養(yǎng)基500微升，放置于37℃搖床200rpm1小時；涂相應抗性平板，37℃培養(yǎng)箱放置過夜；挑克隆，提質粒，酶切鑒定正確的質粒；

第5、將第4步鑒定正確的質粒用AscI切，回收；標記為+pL

第6、10微升體系中加入體外重組酶1微升，buffer2微升，第5步得到的載體+pL和片段R按試劑說明書比例加入，水補齊；體系放置于37℃30min，50℃30min；之后加入40微升pH=8.0的TE，取5微升轉化感受態(tài)細胞；轉化后加LB500微升37℃搖床200rpm1小時；涂相應抗性平板，37℃培養(yǎng)箱放置過夜；挑克隆，提質粒，酶切鑒定正確的質粒；

第7、將第6步鑒定正確的質粒用SalI切，回收；標記為+pLR

第8、10微升體系中加入體外重組酶1微升，buffer2微升，?第7步得到的載體+pLR和片段M按試劑說明書比例加入，水補齊；體系放置于37℃30min，50℃30min；之后加入40微升pH=8.0的TE，取5微升轉化感受態(tài)細胞；轉化后加LB500微升37℃搖床200rpm1小時；涂相應抗性平板，37℃培養(yǎng)箱放置過夜；.挑克隆，提質粒，酶切鑒定正確的質粒；

第9、測序鑒定最終得到的基因敲除載體。