[發明專利]利用基因工程菌株耦合發酵合成GDP-甘露糖體系的構建方法

無效

• 申請號: 200910070580.0
• 申請日: 2009-09-25
• 公開（公告）號: CN101671692A
• 公開（公告）日: 2010-03-17
• 發明（設計）人: 李玉;孔董俊;王春霞;路福平
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P19/32;C12R1/19
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司
• 代理人: 王來佳

技術領域

本發明涉及的是基因工程領域中基因工程菌株的構建技術，尤其是一種利用基因工程菌株耦合發酵合成GDP-甘露糖體系的構建方法。

背景技術

WHO對來源于14個國家的36項調查發現，在出生后6個月內，母乳喂養嬰兒的痢疾發生率比非母乳喂養嬰兒平均低4-5倍。

母乳之所以能夠有效降低新生嬰兒痢疾的發病度和死亡數，主要歸因于其含有抗感染、抗炎癥等多種免疫調節因子，主要包括分泌型抗體(sIgA)、寡糖、乳鐵蛋白、白細胞、細胞因子等。由于新生嬰兒的免疫系統在2周歲之前未能完全發育成熟，母乳中這些因子可通過干擾病原菌在腸道上的粘附、調節機體對病原菌的炎性反應、刺激腸道系統和免疫系統的成熟而達到抵抗嬰兒疾病的目的。

人乳寡糖的含量在乳糖、脂類之后，為人乳中第三大物質。研究表明，母乳喂養或用添加有人乳寡糖的母乳替代品喂養的嬰兒，其糞便中的有害細菌數大大降低；同時，與通常母乳替代品喂養嬰兒相比，因細菌感染而引起的死亡率也明顯降低。由此可見，人乳寡糖具有明顯的抗感染和某些重要的非特異性免疫學功能，一些研究也證明了人乳寡糖能促進嬰兒消化道中雙岐桿菌的增殖，并使梭狀芽胞桿菌和腸球菌的數量大大減少。

人乳寡糖的抗病原菌粘附功能引起了人們的廣泛關注，許多醫藥公司也開始進行以人乳寡糖及其類似物的抗粘附藥物的開發與臨床研究，但是，人乳寡糖的大量獲得并不容易。目前，關于人乳寡糖的功能與制備研究在我國仍未得到有效開展，我國對功能寡糖類物質的開發主要集中在對天然植物、微生物多糖采用酸、堿、酶、氧化等化學方法進行降解制備低分子量的寡糖，如殼寡糖、果寡糖等，這類產品目前已成功上市。對寡糖藥物的開發雖也在不斷進行中，但僅是用化學合成方法進行制備，并且大多數工作僅處于研究階段。也有研究單位或企業通過微生物發酵方法生產一些低聚糖類，但僅是利用微生物體內正常酶系進行生產，而對通過基因工程技術開發寡糖的研究還未進行。隨著越來越多的糖苷酶及其基因的不斷解析以及微生物代謝調控路線的不斷闡明，構建代謝工程菌生產結構特定、功能明確的寡糖成為可能。但是，如何獲得大量廉價的糖基供體對于寡糖的制備也是至關重要的。目前，無論化學法或酶法合成寡糖，其所需糖基供均體價格不菲。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用基因工程菌株耦合發酵合成GDP-甘露糖體系的構建方法，該構建方法利用E.coli表達系統，對以甘露糖為底物合成GDP-甘露糖的相關酶進行高效表達，利用基因重組技術構建含這三種酶的重組大腸桿菌菌株，進行耦合發酵作用合成GDP-甘露糖的方法，該方法構建的工程菌株能增加三個酶基因的拷貝數，提高酶的表達量，從而能作用于底物甘露糖合成GDP-甘露糖。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種利用基因工程菌株耦合發酵合成GDP-甘露糖體系的構建方法，構建方法包括以下步驟：

(1)基因擴增：根據大腸桿菌K-12基因組中己糖激酶基因glk、磷酸甘露糖變位酶基因manB和甘露糖-1-磷酸鳥苷酰轉移酶基因manC的序列設計引物，擴增出大腸桿菌中的三個酶基因序列；

(2)重組質粒的構建：用酶切連接的方法分別將上述三種目的基因與載體pET-22b相連，得到攜帶酶基因的重組表達載體，并進行雙酶切驗證；

(3)基因工程菌株的構建：將上述驗證正確的重組表達載體轉化入宿主菌株BL21(DE3)中，得到含有重組質粒的三種基因工程菌株；

(4)混合發酵合成GDP-甘露糖：三個基因工程菌株的混合發酵，通過改變細胞通透性使工程菌株的產物作用于甘露糖合成GDP-甘露糖。

而且，所述步驟(3)的三種基因工程菌株分別為：BL21(DE3)/pET-22b-glk、BL21(DE3)/pET-22b-manB和BL21(DE3)/pET-22b-manC。

而且，所述步驟(4)混合發酵培養基的組成成分為g/L：BL21(DE3)/pET-22b-gL濕重25；BL21(DE3)/pET-22b-manB濕重15；BL21(DE3)/pET-22b-manC濕重25；甘露糖30；植酸5；KH₂PO₄?25；MgSO₄.7H₂O?5；ATP?5；Nymeen?S-215?4。

本發明的積極效果：