[發明專利]一種豬胸膜肺炎放線桿菌的重組外膜蛋白、編碼基因、表達載體及其制備方法

無效

• 申請號: 200910070452.6
• 申請日: 2009-09-16
• 公開（公告）號: CN101691396A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發明（設計）人: 楊建德;劉燕霏;徐軍;李本強;馬吉飛;楊升;楊百亮;張安國
• 申請（專利權）人: 天津農學院
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/31;C12N15/63;C12N15/70;C12P21/02;C12R1/01;C12R1/19
• 代理公司: 天津市鼎和專利商標代理有限公司 12101
• 代理人: 王淦緒

技術領域

本發明涉及豬胸膜肺炎放線桿菌，尤其是一種豬胸膜肺炎放線桿菌的重組外膜蛋白、編碼基因、表達載體及其制備方法。

背景技術

豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus?pleuropneumoniae，APP)引起豬傳染性胸膜肺炎(Porcine?contagious?pleuropneumoniae，PCP)，該病以肺出血、壞死和纖維素性滲出為主要病變的接觸性傳染病。PCP在世界各地廣泛流行，常常造成巨大的經濟損失，是國際公認的危害現代養豬業的五大疾病之一。英國的Paffison于1957年首次報道了該病，Maffhews和Paffison于1961年從阿根廷爆發豬傳染性胸膜肺炎的豬群中分離到此菌，至20世紀80年代已在世界廣泛流行，且有逐年增長趨勢，近年來國際公認為危害現代養豬業的重要傳染病之一(Nicolet?J.Taxonomy?and?serological?identification?ofActinobacillus?pleuropneumoniae[J].Can?Vet?J，1988，29：578-580。APP是革蘭氏陰性，有莢膜的多形性小球桿菌，在血液瓊脂平板上呈不透明扁平的圓形菌落，其大小為1～1.5mm，周圍呈β溶血，用白金耳觸之有粘性感，金黃色葡萄球菌可增強其溶血性(CAMP實驗陽性)，兼性厭氧，無運動力，生長需要V因子。目前由于該病致病菌的血清型多、分布地域廣，加上其易產生抗藥性及傳統的滅活疫苗來防治該病仍不是很成功等原因給該病的防制工作帶來很大困難。

APP可產生多種毒力因子，如Apx、菌毛和LPS等。Apx是APP分泌的一類溶血毒素，也是APP主要的毒力因子，不同菌株血清型毒力的強弱與Apx毒素種類有關。目前，發現的APP的15個血清型共產生四種Apx，Apx?I、ApxII、ApxIII、ApxIV。它們都屬于RTX(repeating?structure?toxin，RTX)。四種毒素都具有CAMP效應，即與金黃色葡萄球菌共培養時，其溶血效應會加強。不同APP血清型產生的毒素不同。其中產Apx?I和ApxII毒素的血清型毒力最強。在APP的致病過程中Apx毒素的作用是溶解紅細胞，還具有調節白細胞活性的功能。ApxII有較弱的溶血活性，它對肺泡巨噬細胞和嗜中性白血球也具有細胞毒性作用，ApxIII毒素沒有溶血活性，但是它對肺泡巨噬細胞和嗜中性白細胞毒性很強。Apx具有強免疫原性，業已有許多關于Apx作為疫苗潛在成分的研究報道。Zhang(Y.Zhang，J.M.Tennent，A.Ingham?et?al.Identification?of?type4?fimbriae?in?Actinobacilluspleuropneumoniae[J]FEMS?Microbiol.Lett.189(2000)15-18.)等人鑒定出血清1、2、7及12型APP的完整菌毛及菌毛亞單位，其他血清型是否產生菌毛尚未見報道。許多革蘭氏陰性菌的LPS在其發病過程中起重要作用細菌粘附宿主細胞后，感染的建立取決于細菌獲得生長必需的營養的能力。在呼吸道內，能獲得足夠的碳水化合物和其他養分受到限制。這種能夠在宿主內克服營養的限制是感染發病的前提，此外克服鐵離子限制是對許多細菌至關重要的。APP表達許多涉及鐵離子攝取的蛋白因子，利用豬的鐵轉移蛋白作為鐵的唯一來源。在鐵離子限制的條件下，APP可產生兩種結合鐵轉移蛋白的蛋白因子，TbpA和TpbB。TbpA分子量約為100kDa，可能形成鐵離子轉運通過外膜的跨膜通道；TbpB是一個脂蛋白，分子量為60kDa左右，結合在外膜上；這兩個蛋白存在于細菌表面，主要結合于豬鐵轉運蛋白的C葉區。TbpA和TpbB的基因tpbA和tpbB已被克隆出，與exbBD基因連鎖和共轉錄。ExbB和ExbD與TonB結合形成內膜蛋白復合物，為鐵離子跨越外膜提供能量。Tonpitak等證實ExbB和ExbD是APP攝取鐵所必需的。對含溶血素和轉鐵蛋白亞單位疫苗的免疫功能進行了研究。結果表明，含溶血素和轉鐵蛋白結合蛋白亞單位疫苗對攻毒提供部分保護(Janine?T.Bossé，Janson，Brian?J.Sheehan?etal.Actinobacillus?pleuropneumoniae：pathobiology?andpathogenesis?of?infection[J].Microbes?and?Infection?4(2002)225-235)。因此，對豬胸膜肺炎放線桿菌的研究，有助于進一步了解該病的發病機制，可更好的診斷并預防此病，具有十分重要的意義。