[發(fā)明專利]定量檢測(cè)人血清TRAb板式熒光酶免方法及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910070407.0
• 申請(qǐng)日: 2009-09-11
• 公開（公告）號(hào): CN101692085A
• 公開（公告）日: 2010-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方佩華;李寧;陳慧;王少艷;譚建
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院
• 主分類號(hào): G01N33/543
• 分類號(hào): G01N33/543;G01N21/64;G01N33/564;C07K14/72
• 代理公司: 天津佳盟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 廖曉榮

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)超微量檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，是以多孔板做載體制備固相抗原酶標(biāo)板，用于定量檢測(cè)人血清TRAb(以TSAb為主)的板式熒光酶免方法(FEIA)及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】

Graves’病(GD)是一種多發(fā)的自身免疫性甲狀腺病(AITD)，促甲狀腺素受體(TSHR)是GD發(fā)病中最主要的自身抗原。TSHR是存在甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞(TEC)膜上的一種糖蛋白，它與促甲狀腺素(TSH)結(jié)合后，調(diào)節(jié)TEC的生長(zhǎng)、分化及其合成和釋放甲狀腺激素的功能。在環(huán)境和遺傳因素基礎(chǔ)上，機(jī)體免疫功能異常變化導(dǎo)致AITD，TSHR是AITD的主要自身抗原之一，刺激機(jī)體產(chǎn)生促甲狀腺素受體抗體(TRAb)，該自身抗體屬于異質(zhì)性抗體，包括甲狀腺刺激性抗體(TSAb)和甲狀腺阻斷性抗體(TSBAb)，前者模擬TSH功能，長(zhǎng)期持續(xù)地刺激甲狀腺激素合成釋放而導(dǎo)致GD，表現(xiàn)功能亢進(jìn)；后者與TSHR特異位點(diǎn)結(jié)合而阻止TSH與TSHR的結(jié)合及其生理作用的發(fā)揮，表現(xiàn)為甲狀腺功能低下。目前，TSAb對(duì)GD的致病作用已基本肯定，大量研究表明，TSAb的抗原表位主要分布于TSHR膜外區(qū)氨基端。TRAb是GD的主要病因，在GD的發(fā)病、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中起重要作用。檢測(cè)人血清中以TSAb為主的TRAb是GD病因診斷、療效觀察和確定停藥時(shí)機(jī)的重要指標(biāo)。

目前，沒(méi)有比較滿意的國(guó)產(chǎn)TRAb檢測(cè)技術(shù)。國(guó)外引進(jìn)的相關(guān)技術(shù)有2種，(1)放射受體法(2)酶免法，其陽(yáng)性檢出率均不夠理想，不能區(qū)分TSAb和TSBAb，而價(jià)格十分昂貴，且至今在國(guó)內(nèi)未能推廣。國(guó)外還有一種生物學(xué)分析法能區(qū)分TSAb與TSBAb，但方法煩瑣，流程長(zhǎng)且價(jià)格昂貴，只能用于科研，不宜常規(guī)使用。近年又有關(guān)于發(fā)光生物學(xué)分析法的報(bào)道，可用于檢測(cè)TSAb和TSBAb。其特點(diǎn)是利用分子生物學(xué)技術(shù)建立TSHR基因與熒光素酶報(bào)告基因共轉(zhuǎn)染且能穩(wěn)定表達(dá)的CHO細(xì)胞系，借光產(chǎn)量的測(cè)定檢測(cè)TSAb活性。該方法可以區(qū)分TSAb和TSBAb，但目前也是初步研究，技術(shù)尚未成熟，還不能用于臨床常規(guī)檢測(cè)。

現(xiàn)有技術(shù)CN2006100153835中公開了人促甲狀腺素受體胞外區(qū)氨基端基因表達(dá)產(chǎn)物及制備方法和該產(chǎn)物在酶免技術(shù)中的應(yīng)用。這種表達(dá)蛋白富含人TSAb的抗原決定簇，具有與人TSAb結(jié)合的免疫活性。所以本發(fā)明以重組hTSHR膜外區(qū)氨基端蛋白做抗原，以多孔位塑料板為固相載體的定量檢測(cè)人TRAb(以TSAb為主)的熒光酶免疫技術(shù)，創(chuàng)建我國(guó)自己的檢測(cè)TRAb且對(duì)TSAb和TSBAb能有所區(qū)分的檢測(cè)技術(shù)十分必要，是廣大臨床醫(yī)師的迫切要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明的目的在于用重組hTSHR膜外區(qū)氨基端蛋白做抗原包被于酶標(biāo)板上制備固相酶標(biāo)板，以此建立板式固相定量檢測(cè)人TRAb(以TSAb為主)FEIA技術(shù)。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的方案是設(shè)計(jì)一種定量檢測(cè)人血清TRAb板式熒光酶免方法，其特征在于用重組hTSHR膜外區(qū)氨基端蛋白做抗原包被多孔板，用含1-5％BSA的PBST封閉；然后再以多孔板做載體加入抗hTSHR第一抗體或標(biāo)準(zhǔn)品、再依次酶標(biāo)第二抗體、熒光底物和終止液，最后在熒光發(fā)光分析儀上測(cè)定熒光強(qiáng)度。

本發(fā)明定量檢測(cè)人血清TRAb板式熒光酶免方法的用途，用于檢測(cè)以TSAb為主的TRAb熒光酶免法FEIA。定量檢測(cè)人TRAb(以TSAb為主)的熒光酶免疫法，可做為臨床GD甲亢的病因診斷、療效觀察和確定停藥時(shí)機(jī)的重要指標(biāo)。

本發(fā)明的積極效果：

1、以重組hTSHR膜外區(qū)氨基端蛋白做抗原包被在固相載體多孔板上，進(jìn)而用此成功地建立了定量檢測(cè)人TRAb(以TSAb為主)FEIA。

2、建立的板式固相定量檢測(cè)人TRAb(以TSAb為主)FEIA是把酶聯(lián)免疫分析ELISA與熒光檢測(cè)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，具有高度的敏感性和特異性，操作方便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)，并可在熒光分析儀上迅速讀出結(jié)果。而且多孔位塑料板來(lái)源方便，價(jià)格低廉，易于臨床推廣應(yīng)用。

3、建立的板式固相定量檢測(cè)人TRAb(以TSAb為主)FEIA已用于臨床檢測(cè)自身免疫性甲狀腺病，特別對(duì)GD甲亢的病因診斷、療效觀察和確定停藥時(shí)機(jī)有重要價(jià)值，對(duì)鑒別自身免疫性和非自身免疫性甲狀腺病也有重要的臨床意義。

【附圖說(shuō)明】

圖1為TRAb標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2為hTSHR膜外區(qū)氨基端蛋白抗原與人TRAb和hTPOAb結(jié)合反應(yīng)曲線；

圖3為平行實(shí)驗(yàn)曲線圖；

圖4為相關(guān)性檢測(cè)曲線圖；