[發明專利]一種新型嗜熱鏈球菌細菌素的生產方法

有效

• 申請號: 200910069707.7
• 申請日: 2009-07-13
• 公開（公告）號: CN101608201A
• 公開（公告）日: 2009-12-23
• 發明（設計）人: 譚之磊;李琳;賈士儒;王國良;范寶慶;曹美娜;莫治文
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C07K14/315;C07K1/14;A23L3/3463;A23C3/08;A23C13/16;A23C15/20;A23C19/11;A23B4/20;A23L2/44;A23B7/154;A21D2/26;A61K38/00
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技術領域

本發明涉及嗜熱鏈球菌細菌素的生產方法。

背景技術

細菌素是由細菌產生的，通常只作用于與產生菌同種的其它菌株或親緣關系很近的種的 一種蛋白類抗菌物質。它是一種多肽或多肽與糖和脂的復合物。

乳酸菌所產的細菌素引起人們的特別興趣。因為這些菌種總體上被認為是安全的。另外， 產細菌素的乳酸菌大多數來自于自然中的食物，所以它們特別適合用于食品中。

目前，對細菌素的研究主要是通過篩選發現產細菌素菌株，并對其特性進行研究。隨著 對細菌素研究的進一步深入，有必要探明細菌素分子特性以及遺傳學特性，而細菌素的純化是 這些研究的重要基礎。目前已經純化出多種細菌素，純化細菌素的方法多種多樣，主要有： 有機溶劑沉淀法、吸附法、熱變性法、離子交換、凝膠層析、高效液相色譜等等。

近幾年，尋找性狀良好并能產細菌素的發酵劑菌種成為研究的目標。嗜熱鏈球菌是鏈球 菌屬的一種，革蘭氏陽性，不產芽孢，無鞭毛，兼性厭氧，成對或成鏈狀出現。嗜熱鏈球菌 為健康人腸道正常菌群，可在人體腸道中生長、繁殖。可直接補充人體正常生理細菌， 調整腸道菌群平衡，抑制并清除腸道中對人具有潛在危害的細菌。嗜熱鏈球菌細菌素是 由嗜熱鏈球菌產生的細菌素，是具有抗菌活性的肽類，在食品方面的應用很重要，尤其與乳 產品的生產有關。產細菌素發酵劑菌株在發酵酸奶的生產過程中可以使酸奶不易受雜菌污染， 并保證發酵過程的穩定性及產品的安全性。

目前國內論文尚未見到嗜熱鏈球菌細菌素生產和應用的相關報道。關于嗜熱鏈球菌產細 菌素的專利只有1994年雀巢公司申請的嗜熱鏈球菌細菌素專利(專利申請號：94190654.X)。 該專利報道了兩種新的嗜熱鏈球菌細菌素氨基酸序列，這兩種細菌素的信號肽、編碼細菌素 的核苷酸序列，特別是編碼具有SEQ?ID?NO：3順序細菌素的操縱子、產生至少一種該細菌素 的菌株，特別是CNCM?I-1351菌株、含有至少一種該細菌素上清提取液的生產方法，該細菌 素在食品，特別是乳酪和酸奶以及化妝品生產中用作抗病原體的活性劑，其提取方法采用的 是三氯醋酸沉淀法。

國外一些文獻有對嗜熱鏈球菌產細菌素相關報道。Olivier?Marciset等人報道了采用裝填 15-Phe樹脂的HR16/10色譜柱從嗜熱鏈球菌發酵液中分離純化嗜熱鏈球菌細菌素13，該細菌素 是由抗菌肽ThmA和加強因子ThmB組成的。A.G.Mathot等分離到產細菌素的嗜熱鏈球菌580， 該菌產的細菌素對熱不穩定，60℃熱處理1h后活性完全喪失。

發明內容

本發明的目標是提供一種新型嗜熱鏈球菌細菌素的生產方法。

本發明提供的嗜熱鏈球菌細菌素是由嗜熱鏈球菌(Streptococcus?thermophilus)CGMCC 1.1864發酵生產并經分離純化后得到的。

嗜熱鏈球菌細菌素的發酵生產方法：采用的培養基為改良MRS培養基，其組成為：葡萄 糖10～30g/L、蛋白胨1～10g/L、牛肉膏1～10g/L、酵母膏0.5～5g/L、K₂HPO₄·3H₂O?0.1～2g/L、 乙酸鈉0.5～5g/L、檸檬酸銨0.1～2g/L、MgSO₄·7H₂O?0.01～0.58g/L、MnSO₄?0.01～0.25g/L、 吐溫-80?0.01～0.1mL/L。

培養方式為三角瓶靜置培養或低速搖床振蕩培養，或發酵罐培養。

所述方法中的培養條件為28～37℃，培養時間為12～36h，培養至菌體密度約10⁶～10⁹cfu/mL。

發酵得到的嗜熱鏈球菌細菌素按照以下方法進行純化：

將按所述培養方法得到的發酵液調節pH?5.0～6.5，4～30℃振蕩2～12h使細菌素充分吸附 到菌體上。然后，離心收集菌體，用pH6.0的磷酸鈉溶液(5mmol/L)洗滌菌體1～3次，最 后將菌體懸浮于pH?2.0的NaCl溶液(100mmol/L)中，振蕩5～12h后離心去除菌體。取上 清液調節pH?6.0，旋轉蒸發，濃縮10～20倍，所得細菌素粗提液采用Sephadex?G-25層析柱 進一步除鹽和雜蛋白。凝膠層析洗脫條件為：流速為0.5～2mL/min，用去離子水進行洗脫， 合并收集的嗜熱鏈球菌細菌素活性峰溶液。