[發明專利]一種檢測海水中病原菌污染的寡核苷酸微陣列技術

無效

• 申請號: 200910069425.7
• 申請日: 2009-06-24
• 公開（公告）號: CN101580877A
• 公開（公告）日: 2009-11-18
• 發明（設計）人: 黃熙泰;許晶晶;李永君;田雪瑩;孫謙
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B40/06;C12R1/63;C12R1/01;C12R1/385;C12R1/42;C12R1/445;C12R1/145
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技術領域

本發明屬于海水污染監測領域，主要內容是一種寡核苷酸微陣列技術，能夠高通量地監測海水中病原細菌污染情況。能夠同時檢測多種致病細菌，包括河流弧菌，副溶血弧菌，溶藻弧菌，霍亂弧菌，擬態弧菌，弗尼斯弧菌，哈維弧菌，創傷弧菌，糞腸球菌，李斯特菌，銅綠假單胞菌，沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，產氣莢膜梭菌。并且這種微陣列技術能夠不通過富集培養，直接從海水中檢測多種指標菌，包括不能被人工培養的細菌，而不受季節的影響。除了能夠評估相應海域的病原菌的污染程度，還能指示該海域是否受到生活廢水污染等。

背景技術

海洋的病原菌污染和其他污染相比，比較隱蔽，但是卻直接威脅到沿岸居民的健康。并且海水病原菌污染的致病細菌種類的分布特點能夠直接反映海水受到生活污水、城市污水的污染情況。檢測海水中致病細菌的分布狀況具有多重意義。

海水中污染病原菌種類多樣，陸地上的一些致病細菌經過地表徑流最終匯入海水中，因此各種能夠導致人類疾病的病原菌都有可能在海水中存在。此外海水中本身自然生存有豐富的病原菌，其中許多病原菌能夠感染人類。這些特點要求海洋病原菌的監測提供盡可能全面和有代表性的檢測信息。

DNA微陣列檢測技術能同時檢測多個病原菌指標，并且可以按照需求對檢測信息進行細化。這一優點正好滿足海水致病菌污染監測的要求。此外，DNA微陣列技術在DNA分子水平檢測，還具有反應靈敏，操作簡單，耗時短，準確性高，易于推廣等特點。由于使用過濾富集，因此不需培養增菌。該技術還能檢出不能人工培養的苛刻性菌和死菌，大大提高陽性率。鑒于這些優點，DNA微陣列技術能夠作為開發海水病原菌檢測的良好技術平臺。

目前，全面檢測海水中的污染病原菌的報道不多，大多數只能夠檢測有限的少數種病原菌。比如多重PCR技術。但是檢測兩三種菌病不能有效地給出海水病原菌的整體污染狀況。并且多數已報道的海水檢測技術并不是以評估海水污染狀況為目的。而DNA微陣列技術能夠很好地克服這些缺點。

發明內容

本發明的目的是提供一種綜合監測海水中多種病原菌及污染指標菌的寡核苷酸微陣列技術。該微陣列技術以16S-23S?rRNA基因轉錄間區序列作為檢測靶點，通過一次聚合酶鏈式反應擴增，并同時獲得地高辛標記，然后進行寡核苷酸雜交；通過酶標抗體催化底物顯色，判讀獲得監測結果。檢測信息豐富詳盡，具有高通量的特點。并且檢測不需要通過目標菌培養富集，能夠在較短的時間內快速得到檢測結果。本發明是通過以下技術方案實現的：一種檢測海水中病原菌污染的寡核苷酸微陣列技術的43條探針序列如下：

本發明中寡核苷酸微陣列技術使用方法如下：

(1)寡核苷酸微陣列制作：

1)制備探針稀釋液：1×鮭魚精DNA溶液(1g/L)

2)制備探針溶液：用探針稀釋液配置成0.1ug/μL探針溶液

3)把探針溶液點于5cm×5cm尼龍膜基質上，80℃保溫2小時。

探針點樣順序如下表：