[發明專利]一種檢測海水中病原菌污染的寡核苷酸微陣列技術

無效

• 申請號: 200910069425.7
• 申請日: 2009-06-24
• 公開（公告）號: CN101580877A
• 公開（公告）日: 2009-11-18
• 發明（設計）人: 黃熙泰;許晶晶;李永君;田雪瑩;孫謙
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B40/06;C12R1/63;C12R1/01;C12R1/385;C12R1/42;C12R1/445;C12R1/145
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測海水中病原菌污染的寡核苷酸微陣列技術，其特征在于，微陣列的43條探針序列如下：

2.按照權利要求1所述的一種檢測海水中病原菌污染的寡核苷酸微陣列技術，其特征在于，該寡核苷酸微陣列技術使用方法如下：

(1)寡核苷酸微陣列制作：

1)制備探針稀釋液：1×鮭魚精DNA溶液(1g/L)，

2)制備探針溶液：用探針稀釋液配置成0.1ug/μL探針溶液，

3)把探針溶液點于5cm×5cm尼龍膜基質上，80℃保溫2小時；

探針點樣順序如下表：

??Vp710b??Keliarv??Vfu710b??Vvgpro??N1386??Sal-1??Cp-2??Con??Vpiapro??Val2??Vm710b??Tetglavm??N1385??PSE-3??Cp-1??Riverglavr??Val1??Vm710e??Vviapro??N1384??PSE-2??Str-2??Vf710e??Vp-n1??Mchar??Vh710e??Lis-3-RV??PSE-1??Str-3??vfl-n2??Hemglvm??Vc710e??Vh710b??Lis-2-RV??N1388??Sal-3??vfl-n1??Vp710e??Vc710b??Vfu710e??Lis-1-RV??N1387??Sal-2??Cp-3

(2)海水樣本處理和DNA提取

1)樣本處理

①取表層海水20L，分裝于滅菌處理的塑料桶中，取得的海水在3h內進行處理；

②先用0.15毫米孔徑篩子過濾除去懸浮物質，然后用Mini-pellicon?system(Millipore，美國)進行加壓過濾收集菌體，濾膜孔徑為0.22μm(Milipo，美國)。每過濾2L海水對應一張濾膜，即每2L海水作為一個樣本，每個采樣點對應10個平行樣本；

③用無菌水將濾膜上的菌體沖洗下來，并立即用10000r/min離心5min收集菌體。收獲的菌體和雜質沉淀用于DNA抽提；

2)DNA提取

①海水菌體過濾得到樣本的菌體和泥沙懸濁液12000r/min離心2min；

②沉淀物加入550μL的TE緩沖液(10mM?Tris·HCl，1mM?EDTA；pH?8.0)，反復吹打使之重新懸浮，加入30μL?10％SDS和15μL的蛋白酶K，混勻，37℃溫育1h；

③加入100μL?5mol/L?NaCl，混勻，再加入80μL?CTAB/NaCl溶液(5g?CTAB溶于100mL0.5M?NaCl溶液中)，混勻，65℃溫育10min；

④加入等體積的酚/氯仿/異戊醇充分混勻，離心4-5min，將上清轉入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇，輕柔顛倒混勻，-20℃放置20min；

⑤沉淀用1mL的70％乙醇洗滌，倒置干燥，重溶于50μL?TE緩沖液；

⑥DNA樣品煮沸5分鐘然后在冰上淬火，-20℃保存備用；

(3)聚合酶鏈式反應和地高辛標記

1)擴增和標記體系：

試劑????????????????????????體系中各組分終濃度和體積(μL)

10×聚合酶鏈式反應Buffer????5.0μL

F-E-T???????????????????????10μmol/L(4.0μL)

B-E-T???????????????????????10μmol/L(4.0μL)

dNTP????????????????????????10mmol/L(0.3μL)

Digoxigenin-11-dUTP?????????25nmol/L(0.3μL)

DNA模板?????????????????????5.0μL

Taq?DNA?Polymerase??????????5U/μL(0.3μL)

雙蒸水??????????????????????31.1μL

總計????????????????????????50.0μL

10×聚合酶鏈式反應Buffer：Tris-HCl?pH8.5，100mmol/L；KCl，500mmol/L；

MgCl₂，15mmol/L；

2)聚合酶鏈式反應程序

①預變性階段：????????????95℃5min

②第一循環階段(5個循環)：?94℃30sec

??????????????????????????54℃30sec

??????????????????????????72℃50sec

③第二循環階段(5個循環)：?94℃30sec

??????????????????????????56℃30sec

??????????????????????????72℃40sec

④第三循環階段(10個循環)：94℃30sec

??????????????????????????58℃30sec

??????????????????????????72℃40sec

⑤第三循環階段(15個循環)：94℃30sec

??????????????????????????62℃40sec

⑥結束階段：??????????????72℃5min

??????????????????????????4℃保溫

(4)雜交檢測過程

雜交反應使用美國Roch公司地高辛檢測試劑盒；

1)每個寡核苷酸微陣列浸入600μL雜交液(Roch公司)中50℃預雜交45min；

2)將地高辛標記的PCR擴增產物95℃變性10min然后淬火；

3)將50μL變性的PCR產物加入到600μL新換的雜交液(Roch公司)中，加入預雜交完的尼龍膜50℃晃動雜交1小時；

4)雜交完成后將膜冷卻，室溫下分別用2×SSC(+0.1％SDS)，0.5×SSC(+0.1％SDS)和洗滌緩沖液(Roch公司)按順序各洗滌2min；

5)用封閉液封閉30min，加入酶聯抗-地高辛抗體結合30min；

6)用洗滌緩沖液洗滌15min×2次，用檢測緩沖液(Roch公司)平衡5min，加入含色原底物的顯色液避光顯色2小時后觀察結果；

20×SSC：175.3g?NaCl和88.2g檸檬酸鈉，溶于800mL水，加入NaOH調節pH至7.0，定容1L；

2×SSC：將20×SSC用水稀釋10倍；

0.5×SSC：將20×SSC用水稀釋40倍。

3.一種檢測海水中病原菌污染的寡核苷酸微陣列技術在檢測其它海水水域中病原菌污染的應用。