[發明專利]一種水環境病毒高效、快速的富集方法

無效

• 申請號: 200910069390.7
• 申請日: 2009-06-23
• 公開（公告）號: CN101928697A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發明（設計）人: 金敏;李君文;王新為;邱志剛;諶志強;王景峰;陳照立
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;C12R1/92;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種水環境中病毒高效而快速的富集方法。

背景技術

環境中存在的各種致病病毒對人類健康造成了極大的危害。目前已經證實，城市污水尤其生活污水中含有大量種類的病毒，如脊髓灰質炎病毒、甲肝病毒、輪狀病毒等等，且含量在5×10⁶PFU/L以上。這些病毒以水為媒介，經常引發傳染病的爆發流行，因此必須對這些病毒進行高效而快速的監測，阻斷其傳播的途徑。

目前，對環境水體和污水中病毒的富集方法較多，包括陰電荷、陽電荷過濾濃集方法，無機、有機沉淀法，無煙煤、樹脂吸附法等。Fattal等采用陽電荷吸附-洗脫方法可以使水中腸道病毒回收率達到50～77％；Ma等采用MK和1MDS過濾方法可以回收水中73～90％的Polio病毒；Bass等報道采用“Zeta?Plus”陽電荷過濾器結合有機絮凝沉淀富集回收污水中的輪狀病毒，結果發現回收的病毒低于檢測限；Singh等采用同種設備富集水中的細菌病毒-f2噬菌體、MS2噬菌體，回收率只有16％～44％；Goyal等的回收率也只有55％左右；Rose及Kittigul分別比較了陰、陽電荷富集水中細菌病毒和輪狀病毒的效果，結果兩者的回收率相當；目前報道污水中病毒回收率最高的是Mehnert等采用“Zeta?Plus”陽電荷過濾器回收污水中的輪狀病毒，并用PCR方法檢測，病毒回收率達81％；此外，還有采用有機絮凝或鋁鹽沉淀、玻璃纖維、瀝青煤、樹脂等回收污水中的病毒，并用細胞培養法或PCR檢測病毒，回收率在40％～80％左右。由此可見，盡管水中病毒的富集方法已有較多的報道，但效果好或具有實用價值的卻很少，主要問題有：或病毒回收率低(大多數低于60％)，效果不穩定；或易受水質條件影響，尤其是污水濁度的限制；或可處理的水樣量太小(絮凝沉淀法處理污水量一般小于1升)，無實際應用價值；或在回收病毒同時，也將水中對組織細胞培養有毒性的物質濃集，導致假陽性結果；或操作復雜，成本較高。

發明內容

本發明的目的是提供一種高效、快速的水環境病毒富集方法。本發明可以將待檢樣本中大于50個/ml的病毒進行分離與濃集，分離濃集時間為30分鐘左右。

本發明的技術方案概述如下：

一種高效、快速的水環境中病毒富集方法，其特征是包括如下步驟：

①葡聚糖納米磁顆粒的制備：

a.將0.5～1.2mol/L的FeCl₃·6H₂O水溶液10～20ml與0.5～2.5mol/L?FeCl₂·4H₂O水溶液2～6ml混合，在氮氣氛圍下，滴加至10～30ml的30～70％的葡聚糖T-40水溶液中，所述葡聚糖T-40水溶液的濃度為g/ml百分比濃度，50～70℃，水浴10～30分鐘，在150～500轉/分鐘的攪拌下，10～30分鐘內，向混合液中滴加3～7mol/L的氨水35-45ml，溫度保持50～70℃，并始終通氮氣，制成懸液；

b.將懸液用乙酸或稀鹽酸調至pH為6.0-8.0；

c.將懸液中的聚集體在600×g下離心10～20分鐘去除游離的葡聚糖后，經聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝膠層析柱過濾獲得葡聚糖納米磁顆粒，其中洗脫平衡液為pH為6～8的0.005～0.02mol/L磷酸鹽緩沖液，收集的顆粒經冷凍干燥，最后獲得的葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為5～10mg/ml；

d.取葡聚糖納米磁顆粒懸液0.5～2.0ml，加入10～30mmol/L?NaIO₄水溶液0.25ml，150轉/分鐘避光阻氧震蕩0.5～12小時后，加入1～3mol/L乙二醇的水溶液0.1～0.3ml終止氧化，用pH為6～8的0.005-0.02mol/L磷酸鹽緩沖液4℃透析18～48小時，去除過量的NaIO₄，使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為3～8mg/ml；

②納米免疫磁性顆粒懸液的制備

向葡聚糖納米磁顆粒懸液中加入10～30μg/mg葡聚糖納米磁顆粒量的病毒抗體，混勻后，4℃避光放置6～24小時，加入0.2～1mol/LNaBH4水溶液還原10～60分鐘，加入NaBH₄的量為0.1～0.5ml/ml葡聚糖納米磁顆粒懸液，多余的抗體用Sephacryl?S-300凝膠層析柱過濾與結合物分離，制成特定病毒的納米免疫磁顆粒懸液。

③富集水環境中特定病毒