[發(fā)明專利]一種水環(huán)境病毒高效、快速的富集方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910069390.7
• 申請日: 2009-06-23
• 公開（公告）號: CN101928697A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發(fā)明（設計）人: 金敏;李君文;王新為;邱志剛;諶志強;王景峰;陳照立
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;C12R1/92;C12R1/93
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種水環(huán)境病毒高效、快速的富集方法，其特征是包括如下步驟：

①葡聚糖納米磁顆粒的制備：

a.將0.5～1.2mol/L的FeCl₃·6H₂O水溶液10～20ml與0.5～2.5mol/L?FeCl₂·4H₂O水溶液2～6ml混合，在氮氣氛圍下，滴加至10～30ml的30～70％的葡聚糖T-40水溶液中，所述葡聚糖T-40水溶液的濃度為g/ml百分比濃度，50～70℃，水浴10～30分鐘，在150～500轉/分鐘的攪拌下，10～30分鐘內，向混合液中滴加3～7mol/L的氨水35-45ml，溫度保持50～70℃，并始終通氮氣，制成懸液；

b.將懸液用乙酸或稀鹽酸調至pH為6.0-8.0；

c.將懸液中的聚集體在600×g下離心10～20分鐘去除游離的葡聚糖后，經聚丙烯酰胺葡聚糖S-300凝膠層析柱過濾獲得葡聚糖納米磁顆粒，其中洗脫平衡液為pH為6～8的0.005～0.02mol/L磷酸鹽緩沖液，收集的顆粒經冷凍干燥，最后獲得的葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為5～10mg/ml；

d.取葡聚糖納米磁顆粒懸液0.5～2.0ml，加入10～30mmol/LNaIO₄水溶液0.25ml，150轉/分鐘避光阻氧震蕩0.5～12小時后，加入1～3mol/L乙二醇的水溶液0.1～0.3ml終止氧化，用pH為6～8的0.005-0.02mol/L磷酸鹽緩沖液4℃透析18～48小時，去除過量的NaIO₄，使葡聚糖納米磁顆粒懸液的濃度為3～8mg/ml；

②納米免疫磁性顆粒懸液的制備

向葡聚糖納米磁顆粒懸液中加入10～30μg/mg葡聚糖納米磁顆粒量的病毒抗體，混勻后，4℃避光放置6～24小時，加入0.2～1mol/LNaBH4水溶液還原10～60分鐘，加入NaBH₄的量為0.1～0.5ml/ml葡聚糖納米磁顆粒懸液，多余的抗體用Sephacryl?S-300凝膠層析柱過濾與結合物分離，制成特定病毒的納米免疫磁顆粒懸液。

③分離、濃集水環(huán)境中病毒

在1ml檢測樣本中加入納米免疫磁顆粒懸液2～20μl，吸附3～20分鐘，在15～35℃，磁板吸引2-10分鐘，棄上清后用含體積百分比為0.05％～0.1％的吐溫-20的0.005～0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液0.5～1.0ml洗滌一次，加入0.1ml生理鹽水即可制成濃集的病毒懸液。