[發(fā)明專利]一種降壓肽活性的體外檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910067481.7
• 申請(qǐng)日: 2009-09-02
• 公開（公告）號(hào): CN101638682A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉靜波;劉博群
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 吉林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/37
• 分類號(hào): C12Q1/37;G01N30/74
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬功能食品的檢測(cè)方法領(lǐng)域，涉及降壓肽活性檢測(cè)的方法，尤其涉及利用高效液相色譜與熒光檢測(cè)器聯(lián)用對(duì)蛋清降壓肽的檢測(cè)。

背景技術(shù)

世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定成人血壓≥160/95mmHg為高血壓，據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上約有10億人患有高血壓，每年約有4百萬(wàn)人死于高血壓，平均每8個(gè)死亡個(gè)體中有1個(gè)死于高血壓，目前，高血壓已經(jīng)嚴(yán)重威脅著人類的健康。研究表明某些肽類化合物具有降低血壓的功能，稱之為降壓肽。目前，針對(duì)降壓肽較為普遍應(yīng)用的體外檢測(cè)方法是紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，在血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的作用下水解馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)，經(jīng)過(guò)萃取分離等操作將產(chǎn)物馬尿酸(Hip)分離出，通過(guò)對(duì)比完全反應(yīng)(ACE催化HHL水解)、存在抑制劑的反應(yīng)(ACE在抑制劑存在條件下催化HHL水解)、空白反應(yīng)(將ACE滅活后在抑制劑存在條件下催化HHL水解)三個(gè)反應(yīng)來(lái)確定血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的活性，進(jìn)而確定降壓肽的活性。因此，體外降血壓活性也用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制率來(lái)表示。

但是，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)方法存在操作步驟復(fù)雜、使用有毒有害有機(jī)溶劑、檢測(cè)藥品費(fèi)用高等缺點(diǎn)；近年有報(bào)道高效液相色譜與紫外分光光度計(jì)聯(lián)用來(lái)檢測(cè)水解產(chǎn)物馬尿酸(Hip)，但也存在成本高等弊端；而傳統(tǒng)的熒光分光光度計(jì)檢測(cè)法由于存在肽與鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)的干擾使得檢測(cè)不穩(wěn)定，同時(shí)也存在藥品用量大的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：克服現(xiàn)有的檢測(cè)方法操作步驟復(fù)雜、操作人員直接接觸有害溶劑、檢測(cè)藥品用量高等技術(shù)缺點(diǎn)。本發(fā)明提供了一種運(yùn)用鄰苯二甲醛(OPA)與組胺酰亮氨酸(HL)反應(yīng)生成熒光物質(zhì)，經(jīng)高效液相色譜分離，通過(guò)熒光檢測(cè)器進(jìn)行定量的檢測(cè)方法。本方法方便，靈敏，藥品用量少。

本方法的技術(shù)方案如下：

本方法需要對(duì)比兩組反應(yīng)，要求這兩組反應(yīng)在同樣外界條件下單獨(dú)進(jìn)行，其中，有一組中存在抑制劑(用B表示)，另一組不存在抑制劑(用A表示)。兩組反應(yīng)按如下步驟進(jìn)行：

1、組胺酰亮氨酸(HL)生成反應(yīng)：首先在30℃～40℃條件下將反應(yīng)容器預(yù)熱5～15min，A、B反應(yīng)分別加入相同劑量(10～50μL?0.05U/ml～0.5U/ml)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)，A反應(yīng)中加入10μL的硼酸鹽緩沖溶液(0.1mol/L?pH＝8.3含0.3mol/L?NaCl)，B反應(yīng)中加入與A相同體積一定濃度的降壓肽硼酸鹽緩沖溶液。兩組反應(yīng)同時(shí)加入10～30μL?3～5mmol/L的馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)，在30℃～40℃條件下反應(yīng)20～50mm，反應(yīng)過(guò)程中要保持溫度恒定。

2、組胺酰亮氨酸(HL)生成反應(yīng)的終止及堿性條件的建立：通過(guò)改變pH值，使酶的活性降低至幾乎不再催化水解反應(yīng)。加入300～400μL?0.2～0.4mol/L?NaOH溶液終止反應(yīng)。保證pH值為10.5～14.0

3、熒光物質(zhì)生成：在30℃～40℃條件下加入鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)5～15min。此反應(yīng)要求在堿性條件下進(jìn)行，在稀酸性或中性條件下逆反應(yīng)反應(yīng)速率較快，影響檢測(cè)準(zhǔn)確性。

4、熒光物質(zhì)生成反應(yīng)的終止：通過(guò)調(diào)節(jié)pH值來(lái)終止反應(yīng)，加入30～40μL?2～4mol/L的HCl來(lái)終止反應(yīng)。最終整個(gè)反應(yīng)體系為中性或偏酸性。注：本反應(yīng)終止后應(yīng)盡快稀釋檢測(cè)。

5、液相色譜的分離：采用高效液相色譜法來(lái)分離熒光物質(zhì)，將反應(yīng)液稀釋10～200倍，在流動(dòng)相水與乙腈比例在3∶1～5∶1，流速在0.5～0.8ml/min條件下進(jìn)樣1～10μL，通過(guò)高效液相色譜法將組胺酰亮氨酸(HL)與鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)產(chǎn)物充分分離，避免因肽與鄰苯二甲醛(OPA)反應(yīng)以及肽本身在該條件下發(fā)射熒光干擾。使得檢測(cè)準(zhǔn)確。

通過(guò)如下公式計(jì)算血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制率：

注：A為抑制劑不存在條件下的峰面積；B為抑制劑存在條件下的峰面積。

熒光檢測(cè)方法學(xué)驗(yàn)證：本發(fā)明的檢測(cè)方法在0.0016nmol～0.128nmol線性范圍時(shí)其線性關(guān)系良好，反應(yīng)的回收率為99.26％～103.98％，反應(yīng)的靈敏度較高，反應(yīng)的重現(xiàn)性較好。

本發(fā)明的有益效果在于：簡(jiǎn)化操作的整體步驟，尤其是分離操作的步驟；采用高效液相色譜法提高分離效率，分離效果好；減少藥品的使用量，使檢測(cè)成本降低；避免與有害溶劑的接觸，保證操作人員的身體健康。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1