[發明專利]一種降壓肽活性的體外檢測方法

無效

• 申請號: 200910067481.7
• 申請日: 2009-09-02
• 公開（公告）號: CN101638682A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發明（設計）人: 劉靜波;劉博群
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;G01N30/74
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬功能食品的檢測方法領域，涉及降壓肽活性檢測的方法，尤其涉及利用高效液相色譜與熒光檢測器聯用對蛋清降壓肽的檢測。

背景技術

世界衛生組織(WHO)規定成人血壓≥160/95mmHg為高血壓，據統計，世界上約有10億人患有高血壓，每年約有4百萬人死于高血壓，平均每8個死亡個體中有1個死于高血壓，目前，高血壓已經嚴重威脅著人類的健康。研究表明某些肽類化合物具有降低血壓的功能，稱之為降壓肽。目前，針對降壓肽較為普遍應用的體外檢測方法是紫外分光光度計檢測，在血管緊張素轉化酶(ACE)的作用下水解馬尿酰組氨酰亮氨酸(HHL)，經過萃取分離等操作將產物馬尿酸(Hip)分離出，通過對比完全反應(ACE催化HHL水解)、存在抑制劑的反應(ACE在抑制劑存在條件下催化HHL水解)、空白反應(將ACE滅活后在抑制劑存在條件下催化HHL水解)三個反應來確定血管緊張素轉化酶(ACE)的活性，進而確定降壓肽的活性。因此，體外降血壓活性也用血管緊張素轉化酶抑制率來表示。

但是，采用紫外分光光度計檢測方法存在操作步驟復雜、使用有毒有害有機溶劑、檢測藥品費用高等缺點；近年有報道高效液相色譜與紫外分光光度計聯用來檢測水解產物馬尿酸(Hip)，但也存在成本高等弊端；而傳統的熒光分光光度計檢測法由于存在肽與鄰苯二甲醛(OPA)反應的干擾使得檢測不穩定，同時也存在藥品用量大的問題。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：克服現有的檢測方法操作步驟復雜、操作人員直接接觸有害溶劑、檢測藥品用量高等技術缺點。本發明提供了一種運用鄰苯二甲醛(OPA)與組胺酰亮氨酸(HL)反應生成熒光物質，經高效液相色譜分離，通過熒光檢測器進行定量的檢測方法。本方法方便，靈敏，藥品用量少。

本方法的技術方案如下：

本方法需要對比兩組反應，要求這兩組反應在同樣外界條件下單獨進行，其中，有一組中存在抑制劑(用B表示)，另一組不存在抑制劑(用A表示)。兩組反應按如下步驟進行：

1、組胺酰亮氨酸(HL)生成反應：首先在30℃～40℃條件下將反應容器預熱5～15min，A、B反應分別加入相同劑量(10～50μL?0.05U/ml～0.5U/ml)的血管緊張素轉化酶(ACE)，A反應中加入10μL的硼酸鹽緩沖溶液(0.1mol/L?pH＝8.3含0.3mol/L?NaCl)，B反應中加入與A相同體積一定濃度的降壓肽硼酸鹽緩沖溶液。兩組反應同時加入10～30μL?3～5mmol/L的馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)，在30℃～40℃條件下反應20～50mm，反應過程中要保持溫度恒定。

2、組胺酰亮氨酸(HL)生成反應的終止及堿性條件的建立：通過改變pH值，使酶的活性降低至幾乎不再催化水解反應。加入300～400μL?0.2～0.4mol/L?NaOH溶液終止反應。保證pH值為10.5～14.0

3、熒光物質生成：在30℃～40℃條件下加入鄰苯二甲醛(OPA)反應5～15min。此反應要求在堿性條件下進行，在稀酸性或中性條件下逆反應反應速率較快，影響檢測準確性。

4、熒光物質生成反應的終止：通過調節pH值來終止反應，加入30～40μL?2～4mol/L的HCl來終止反應。最終整個反應體系為中性或偏酸性。注：本反應終止后應盡快稀釋檢測。

5、液相色譜的分離：采用高效液相色譜法來分離熒光物質，將反應液稀釋10～200倍，在流動相水與乙腈比例在3∶1～5∶1，流速在0.5～0.8ml/min條件下進樣1～10μL，通過高效液相色譜法將組胺酰亮氨酸(HL)與鄰苯二甲醛(OPA)反應產物充分分離，避免因肽與鄰苯二甲醛(OPA)反應以及肽本身在該條件下發射熒光干擾。使得檢測準確。

通過如下公式計算血管緊張素轉化酶(ACE)抑制率：

注：A為抑制劑不存在條件下的峰面積；B為抑制劑存在條件下的峰面積。

熒光檢測方法學驗證：本發明的檢測方法在0.0016nmol～0.128nmol線性范圍時其線性關系良好，反應的回收率為99.26％～103.98％，反應的靈敏度較高，反應的重現性較好。

本發明的有益效果在于：簡化操作的整體步驟，尤其是分離操作的步驟；采用高效液相色譜法提高分離效率，分離效果好；減少藥品的使用量，使檢測成本降低；避免與有害溶劑的接觸，保證操作人員的身體健康。

具體實施方式

實施例1