[發明專利]一種降壓肽活性的體外檢測方法

無效

• 申請號: 200910067481.7
• 申請日: 2009-09-02
• 公開（公告）號: CN101638682A
• 公開（公告）日: 2010-02-03
• 發明（設計）人: 劉靜波;劉博群
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;G01N30/74
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1、一種檢測降壓肽體外活性，即檢測血管緊張素轉化酶(ACE)抑制率的方法，采用高效液相色譜與熒光檢測器聯用的方法對血管緊張素轉化酶(ACE)的抑制率進行測定；其特征在于檢測過程主要包括組氨酰亮氨酸(HL)生成、組胺酰亮氨酸(HL)生成反應的終止及堿性條件的建立、熒光物質生成、熒光物質生成反應的終止、熒光物質的檢測五部分。

2、根據權利1所述的檢測降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的組氨酰亮氨酸(HL)生成過程包括：對比兩組獨立的反應A、B，其中A為沒有降壓肽存在下馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)水解生成組胺酰亮氨酸(HL)，B為有降壓肽存在條件下馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)水解生成組胺酰亮氨酸(HL)。具體步驟為：在30℃～40℃條件下將反應容器預熱5～15min，A、B反應分別加入相同劑量(10～50μL0.05U/ml～0.5U/ml)的血管緊張素轉化酶(ACE)，A反應中加入10μL的硼酸鹽緩沖溶液(0.1mol/L?pH＝8.3含0.3mol/L?NaCl)，B反應中加入與A相同體積一定濃度的降壓肽硼酸鹽緩沖溶液；A、B反應同時加入10～30μL底物3～5mmol/L的馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)，在30℃～40℃條件下反應20～50min。

3、根據權利1所述的降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的組胺酰亮氨酸(HL)生成反應的終止及堿性條件的建立過程為：加入300～400μL?0.2～0.4mol/L的NaOH溶液終止組胺酰亮氨酸(HL)生成反應，同時提供堿性反應條件(pH值10.5～14.0)。

4、根據權利1所述的檢測降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的熒光物質生成過程為：在30℃～40℃條件下加入10～50μL的鄰苯二甲醛(OPA)反應5～15min。

5、根據權利1所述的檢測降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的熒光物質生成反應的終止過程為：加入30～40μL?2～4mol/L的HCl。

6根據權利1所述的檢測降壓肽體外活性的方法，其特征在于所述的熒光物質檢測為：將反應液稀釋10～200倍，在流動相水與乙腈比例在3∶1～5∶1，流速在0.5～0.8ml/min條件下進樣1～10μL，通過熒光檢測器檢測，記錄出峰面積。

7、根據權利1所述的檢測降壓肽體外活性的方法，通過方法學檢驗得到本發明的檢測方法線性范圍在0.0016nmol～0.128nmol時其線性關系良好，回收率為99.26％～103.98％，反應的靈敏度較高，反應的重現性較好。