[發(fā)明專利]百白破、A+C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910067156.0
• 申請(qǐng)日: 2009-06-19
• 公開（公告）號(hào): CN101590225A
• 公開（公告）日: 2009-12-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫惠軍;牟盈盈;梁艷婷;李沖;巨爽;楊宗輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 長(zhǎng)春長(zhǎng)生生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/116
• 分類號(hào): A61K39/116;A61K39/05;A61K39/10;A61K39/08;A61K39/095;A61K39/102;A61P31/04
• 代理公司: 吉林長(zhǎng)春新紀(jì)元專利代理有限責(zé)任公司
• 代理人: 陳宏偉

1.一種百白破、A+C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗，每支體積為0.5ml成品含以下組分及含量：

A群腦膜炎球菌多糖：??????10μg

C群腦膜炎球菌多糖：??????10μg

b型流感嗜血桿菌多糖：????10μg

乳糖：???????????????????2.5～3.0mg

無(wú)細(xì)胞百日咳原液：???????18μgPN/ml

白喉類毒素：?????????????25Lf/ml

破傷風(fēng)類毒素：???????????7Lf/ml

氫氧化鋁含量：???????????1.0～1.5mg/ml。

2.權(quán)利要求1所述聯(lián)合疫苗的制備工藝，包括以下步驟：

1)菌種的的選用：選用A、C群腦膜炎奈瑟氏球菌，b型流感嗜血桿菌菌種，用于A、C群腦膜炎球菌-b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗的制備；

2)生產(chǎn)用種子

啟開工作種子批菌種，經(jīng)適當(dāng)傳代，經(jīng)檢定合格后，接種改良半綜合培養(yǎng)基或其他適宜培養(yǎng)基，制備數(shù)量適宜的生產(chǎn)用種子；

3)生產(chǎn)用培養(yǎng)基

采用改良半綜合培養(yǎng)基或經(jīng)批準(zhǔn)的其他適宜培養(yǎng)基，培養(yǎng)基不應(yīng)含有與十六烷基三甲基溴化銨形成沉淀的成分；

4)培養(yǎng)

采用培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中取樣進(jìn)行純菌檢查，涂片做革蘭氏染色鏡檢，如發(fā)現(xiàn)污染雜菌，應(yīng)廢棄；

5)收獲和殺菌

于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期或靜止期的前期終止培養(yǎng)，取樣進(jìn)行菌液濃度測(cè)定及純菌檢查，合格后在收獲的培養(yǎng)液中加入甲醛溶液殺菌，或采用加熱方法殺菌，以確保殺菌安全又不損傷其多糖抗原為宜；

6)去核酸

將已殺菌的單批或多批混合的培養(yǎng)液，離心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化銨，充分混勻，形成沉淀；離心后的沉淀物加入適量氯化鈣溶液，其最終濃度為?1mol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化銨解離，加入乙醇至最終濃度為25％，2-8℃靜置1-3小時(shí)或過(guò)夜，離心收集澄清的上清液；

7)沉淀多糖

于上述上清液中加入冷卻乙醇至最終濃度為80％，充分振搖，離心收集沉淀，用無(wú)水乙醇及丙酮各洗2次以上，將沉淀物即為多糖粗制品，應(yīng)保存在-20℃以下，待純化；

8)多糖純化

將粗制品溶解于1/10飽和中性醋酸鈉溶液中，使其濃度達(dá)10-20mg/ml；按1∶2容量用冷酚，100g結(jié)晶酚溶于40ml的1/10飽和醋酸鈉溶液，提取數(shù)次，離心收集上清液，并用0.1mol/L氯化鈣溶液或其他適宜溶液透析，加入乙醇至終濃度為75％～80％；離心收集的沉淀物用無(wú)水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用滅菌注射用水溶解沉淀物，即為純化多糖原液；提取過(guò)程應(yīng)在15℃以下進(jìn)行；

9)多糖活化、衍化與破傷風(fēng)類毒素結(jié)合

將理化檢定合格的多糖經(jīng)溴化氰活化，加入適宜比例的ADH(1、6-己二酰肼)反應(yīng)過(guò)夜，然后用超濾或其他適宜方法除去溴化氰及未衍化的ADH，過(guò)濾除菌，-20℃保存；取樣進(jìn)行檢定，檢定合格后，將適宜濃度的多糖-AH衍生物與破傷風(fēng)類毒素等量混合，然后加入碳二亞胺，混合物2-8℃保持一定時(shí)間，用0.2M?NaCl溶液透析過(guò)夜，將反應(yīng)物用Sepharose?CL-4B柱層析純化，收集V0部分洗脫液，用NaOH調(diào)pH至中性，除菌過(guò)濾，即為結(jié)合物原液，2-8℃保存；

10)半成品配制及分裝

將檢定合格的A、C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合苗原液、b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗原液與無(wú)細(xì)胞百日咳原液、白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素按比例混合均勻后，按要求進(jìn)行分裝，分裝量0.5mL/瓶，放2-8℃庫(kù)待檢。?