[發明專利]一種用于制備人類疾病動物模型的轉基因豬及其培育方法

無效

• 申請號: 200910066584.1
• 申請日: 2009-03-04
• 公開（公告）號: CN101570763A
• 公開（公告）日: 2009-11-04
• 發明（設計）人: 歐陽洪生;逄大欣;陳立梅;李莉;李占軍;王鐵東;張明軍;任林柱;閆森;宋娜
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 陳宏偉

技術領域：

本發明提供一種用于制備人類疾病動物模型的轉基因豬及其培育方法，通過體細胞核移植技術制備了用于基因敲除的誘導性表達Cre重組酶的轉基因豬，屬于生物醫藥技術領域。

背景技術：

研究人類疾病動物模型可以幫助科學家理解疾病的發病機制、病理過程，甚至研究對疾病進行基因治療，從而治愈人類疾病。迄今為止，小鼠模型已被廣泛用于研究人類造血功能，先天和適應性免疫，免疫，傳染病，癌癥生物學和再生醫學等領域。但是，許多小鼠疾病模型往往不能完全地模仿人類的疾病。豬在解剖、生理、器官發育和疾病發展過程等方面與人類的十分相似。豬動物模型是研究人類疾病的最好的動物模型。

本發明的任務是要建立Mx1-Cre轉基因豬，下一步將用該工具豬去制備人類疾病的基因敲除的動物模型。

發明內容：

本發明提供了一種用于制備人類疾病動物模型的轉基因豬，可用于制備人類疾病的基因敲除的動物模型。

本發明提供用于制備人類疾病動物模型的轉基因豬，其特征在于：

該轉基因豬是由Mx1啟動子啟動Cre重組酶表達的轉基因豬，Cre重組酶可識別loxp位點從而敲除兩個loxp位點之間的基因。

上述轉基因豬的培育方法，包括以下步驟：

采用基因工程的方法構建誘導性表達Cre重組酶表達載體pET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR，用干擾素誘導劑聚肌胞(poly?I：C)進行誘導后能夠表達Cre重組酶，從而用于敲除靶基因；

通過細胞轉染及細胞篩選技術篩選出可以誘導性表達Cre重組酶的豬成纖維細胞；

利用體細胞核移植技術進行克隆豬。

所述的誘導性表達載體pET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR：是以pGL3-Mx1載體為模板，通過PCR循環擴增mx1啟動子；以PMD-Cre載體為模板，通過PCR循環擴增Cre啟動子；以pcDNA3.1(+)載體為模板，通過PCR循環擴增BGHpolyA；從pGCFRT2NeoR載體上用Xho?I?and?Sal?I酶切得到FRT2NeoR盒子；將所擴增的片段和酶切回收片段，分別連入pET28a載體。

具體制備工藝如下：

1、誘導性表達Cre重組酶基因表達載體的構建

1.1Cre重組酶基因的優化?對噬菌體P1的Cre重組酶基因編碼序列密碼子按小型豬基因嗜好密碼子進行優化，克隆出優化的Cre重組酶基因(Cre)，并克隆到PMD18T載體上構建了中間載體pMD-Cre。

1.2載體pCIneo-FRT2neoR的構建?用XhoI和SalI分別將載體pCIneo和pGC-FRT2NeoR進行雙酶切，構建了中間載體pCIneo-FRT2neoR。然后用XhoI和NotI雙酶切獲得FRT2NeoR片段。

1.3Mx1-Cre-BGHpolyA片段的獲得?通過PCR方法分別從pGL3Mx1載體上和pcDNA3.1(+)載體上擴增豬Mx1啟動子和BGHpolyA。將Mx1、Cre和BGHpolyA?3個片段利用SOE-PCR進行連接，連接后產物用Nhe?I和XhoI雙酶切。

1.4PET28a+的處理?用Nhe?I和Not?I雙酶切PET28a+載體，凝膠回收。

1.5PET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR載體的構建?上述酶切處理的片段經T4?DNA連接酶22℃連接過夜，經轉化后，質粒小提，酶切和測序鑒定，獲得Cre重組酶表達載體pET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR。

2、誘導性表達Cre重組酶轉基因豬成纖維細胞的構建

2.1載體線性化?將pET28a-Mx1-Cre-BGHpolyA-FRT2neoR載體質粒大提后用NheI和XhoI雙酶切，然后乙醇沉淀，用高壓ddH₂O溶解。

2.2脂質體轉染?將線性化的載體按照脂質體LipofectamineTM2000說明書進行轉染小型豬成纖維細胞，5％CO₂，39℃培養。

2.3核供體細胞的獲得?用G418篩選8～10天后，獲得抗性細胞。采用PCR方法及和hiTAIL?PCR方法對所獲得的細胞進行鑒定，得到誘導性表達Cre重組酶轉基因豬成纖維細胞。該細胞即為核供體細胞。

3、誘導性表達Cre重組酶轉基因豬的構建