[發明專利]膠體金標記Iap基因單克隆抗體測定單增李斯特菌試劑盒

無效

• 申請號: 200910066422.8
• 申請日: 2009-01-09
• 公開（公告）號: CN101613706A
• 公開（公告）日: 2009-12-30
• 發明（設計）人: 何成彥;賈芙蓉;方玲;李洪軍
• 申請（專利權）人: 何成彥;賈芙蓉;方玲;李洪軍
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/63;C12N9/14;C07K16/40;G01N33/569
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 紀 尚

1、一種膠體金標記Iap基因單克隆抗體測定單增李斯特菌試劑盒，其特征是：

a、引物設計

L.monocytogenes?Iap蛋白基因序列

ORIGIN

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GenBank中的L.monocytogenes?Iap蛋白基因序列，應用Primer?Premier5.0，DNA?Club和Oligo?6.0設計特異性引物P1和P2，預期擴增長度為1434bp，在NCBIGENEBANK中找到基因序列后，看選擇的酶切位點，在所要進行PCR的基因序列中是否存在；用Primer?primer5把序列反向互補；在應用Oligo?6.0引物設計時，上下游引物全長輸入；上游引物位點的確定為5’端模板第一個堿基前面的所有堿基的負數值+1下游引物位點的確定為下游引物-酶切位點-保護性堿基＝A，序列全長-A+1＝下游引物位點；

上游引物P1

5′-GCGGATCCATGAATATGAAAAAAGCAACTATCGCGGC-3′；

下游引物P2

5′-CTCGAGTACGCGACCGAAGCCAACTAGATATT-3′

為下一步克隆需要，分別在上、下游引物中引入BamH?I和Xho?I酶切位點

b、PCR擴增的反應條件

PCR反應條件為94℃預變性3min，94℃變性1min，55-65℃退火1min，72℃延伸2min，擴增30個循環，72℃延伸10min；

c、瓊脂糖凝膠電泳的反應條件

用1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，電壓100V，電泳30min；

d、切下目的DNA片段，用凝膠快速純化回收試劑盒回收；將回收純化的PCR產物與pMD18-T進行連接，并pMD18-T載體16℃12小時以上連接；制備感受態細胞：應用CaCl₂致敏法制備大腸桿菌感受態，接種JM109菌種，37℃，225rpm12小時振搖培養后，菌液在LB固體培養基上劃線，37℃孵箱過夜培養，篩選單克隆；選一單菌落接種于5mL?LB培養基中，12小時以上培養，培養物按1/100接種于LB培養基中，培養至A₆₀₀達0.45-0.55，用CaCl₂致敏大腸桿菌；

e、應用熱休克轉化法，將連接反應液加入100μL感受狀態的細胞中，再加3μlDMSO以增加轉化效率，冰浴30min后，42℃休克45s，然后迅速冰浴5min，再將轉化產物加入LB液體培養基中復蘇30min后，離心收集菌體，將其鋪于含篩選抗生素的LB固體培養基上，37℃恒溫孵箱放置16h后觀察轉化效果；

f、SDS裂解法純化試劑盒制備質粒；用BamH?I和Xho?I進行酶切鑒定及PCR鑒定，篩選出陽性重組質粒，命名為pMD18-T-Iap；用BamH?I和Xho?I進行亞克隆，表達載體pET28a和重組克隆載體pMD18T-Iap用BamH?I和Xho?I切處理，瓊脂糖凝膠電泳，線性表達載體用DNA快速純化回收試劑盒回收，亞克隆片段用擠膠法回收，亞克隆載體與片段用T4DNA連接酶連接，連接產物轉化JM109感受態，提取質粒，鑒定陽性克隆；

g、蛋白的誘導表達

用pET28a-Iap重組質粒轉化BL21受體菌，選擇單克隆接種到5mL?LB培養液里，按傳統方式誘導表達，即37℃，225rpm振蕩培養至A600達0.6-0.8，加IPTG至1mmol/L，對照組不加IPTG，3h后收集細菌；同時接種誘導菌種，提取質粒，BamH?I和Xho?I酶切驗證確含目的片段后，進行測序，測序正確后進行重組蛋白的后續實驗；

h、SDS-PAGE電泳

將誘導后菌液30mL?11000rpm離心2min，棄上清，收集菌體，向菌體沉淀中加入2×SDS凝膠加樣緩沖液1000μl，煮沸5min后進行SDS-PAGE電泳，操作過程如下

12％的分離膠15mL，水4.9mL、30％丙烯酰胺6.0mL、1.5mol/L?Tris-HCl其pH?8.8的3.8mL、10％SDS?150mL、10％過硫酸銨150mL、TEMED?6mL，迅速灌注于兩層玻璃板的間隙，在膠上小心覆蓋一層蒸餾水，凝膠垂直置于室溫，聚合完全后，倒出覆蓋的水，用濾紙將水吸凈；制備8mL積層膠，水5.5mL、30％丙烯酰胺1.3mL、1.0mol/L?Tris-HCl其pH?6.8的1.0mL、10％SDS?80mL、10％過硫酸銨80mL、TEMED?8mL，直接注于分離膠上層，立即在積層膠中插入干凈的Teflon梳子，小心避免形成氣泡；積層膠聚合完全后，小心移出Teflon梳子，將凝膠固定于電泳裝置上，加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液25mmol/L?Tris，250mmol/L甘氨酸，0.1％SDS，上電泳樣品及蛋白質Marker，電壓200v電泳45min，電泳結束后凝膠加入考馬斯亮藍染色，脫色液脫色后，將凝膠浸泡于水中，拍照記錄；

j、從SDS-PAGE電泳凝膠中切下所需條帶，大約用兩天時間將其凍干，并碾成粉末。用考馬斯亮藍法進行蛋白濃度測定，制作蛋白標準曲線；595nm處比色，得吸光度，查標準曲線，得到蛋白濃度；將抗原溶于生理鹽水中，配制濃度為1μg/μl。免疫BALB/c小鼠，4-6周，加強免疫；

小鼠腹水的誘導

取BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟，每只0.5ml.7-10天后，收集雜交瘤細胞，離心，去上清，加入不含血清的培養基，調節細胞密度為3×10⁷個/ml，每只小鼠注射1ml；設陰性對照、鹽水對照。約10天后，小鼠腹部增大，開始收集腹水；用12號針頭扎入腹部，擠壓，使腹水流出，收集至離心管，并使勁晃動離心管防止腹水凝結；1000轉離心5分鐘，吸取上清，注意去掉上面一層脂肪；分裝，-20℃凍存；

k、膠體金的制備采用檸檬酸三鈉還原法并稍作改進制備膠體金；膠體金制備，取1％氯金酸溶液2.5ml加入到250ml容量瓶中，加雙蒸水至標定刻度線，使氯金酸溶液的濃度為1‰，沸水浴10min，加入1％檸檬酸三鈉溶液6.65ml；快速攪拌直至顏色徹底變為紫紅色，繼續沸水10min，取出。涼至室溫后，用雙蒸水恢復至原體積；置4℃冰箱保存備用；

測定膠體金在515nm波長具有最大吸收峰，確定膠體金直徑大小為10nm；

膠體金探針制備：取新鮮制備的膠體金溶液50ml，加入0.2mol/L?K₂CO3，調pH至8.2，置磁力攪拌器上調適量轉速，然后加入適量的已純化好的抗體；

使抗體濃度恰好在穩定蛋白質的最小量上；緩慢攪拌10min，加入牛血清白蛋白BSA，使BSA的終濃度為I％，繼續攪拌10min。將上述膠體金一抗體一BsA液進行4000r/min離心20min，收集上清。將收集的上清進行4℃、10000r/min離心60min。棄上清，沉淀用含1％BSA的0.01mol/L；pH7.4PBS懸浮；同上4℃，10000r/min離心60min兩次，最后將沉淀用5ml?PBS-T溶解；并加入少量的Na₃N，4℃冰箱保存備用；

層析試紙條組裝試紙條由吸水纖維、硝酸纖維膜、玻璃纖維和PVC板組成。硝酸纖維膜處理，中段相隔5mm分別用羊抗鼠IgG對照線和單核李斯特菌抗體檢測線劃線，形成兩條寬約1mm的線段，干燥后用含1％BSA的PBS封閉12小時以上，37℃干燥；

試紙條組裝，取潔凈PVC板，將處理好的硝酸纖維膜粘在PVC板中部合適位置；將2cm吸水纖維粘在PVC板上端并部分壓在硝酸纖維膜上，0.8cm玻璃纖維粘在PVC板下端并部分壓在硝酸纖維膜上，切成寬5mm的條帶，即為層析試紙條；干燥劑密封冷凍保存。