[發明專利]膠體金標記Iap基因單克隆抗體測定單增李斯特菌試劑盒

無效

• 申請號: 200910066422.8
• 申請日: 2009-01-09
• 公開（公告）號: CN101613706A
• 公開（公告）日: 2009-12-30
• 發明（設計）人: 何成彥;賈芙蓉;方玲;李洪軍
• 申請（專利權）人: 何成彥;賈芙蓉;方玲;李洪軍
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/63;C12N9/14;C07K16/40;G01N33/569
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司
• 代理人: 紀 尚

技術領域

本發明屬于衛生學檢驗及醫學檢驗技術領域。

背景技術

李斯特菌屬Listeria分為2個群，7個種。第1群包括單核細胞增生性李斯特菌L.m?onocytogenes(簡稱單增李斯特菌)、伊氏李斯特菌L.ivanovii、無害李斯特菌L.innocua、韋氏李斯特菌L.welshm?ei及塞氏李斯特菌L.seeligeri；第2群為較少見的格氏李斯特菌L.grayi和莫氏李斯特菌L.m?urrayi.其中單增李斯特菌被認為是引起動物和人類李斯特菌病的主要致病菌.單增李斯特菌(Usteria?monocytogenes，Lm)是一種短小的革蘭陽性無芽胞桿菌，是一種人畜共患病的致病菌，可使人和動物患李斯特菌病。研究發現單增李斯特菌包括致病性、弱致病性和非致病性3種類型.單增李斯特菌能使人畜致病，造成豬、雞等多種畜禽死亡。人感染后則主要表現為腦膜炎、敗血癥和單核細胞增多。嬰幼兒、懷孕婦女和免疫耐受病人的感染死亡率可高達20％～30％。單增李斯特菌廣泛存在于自然界中，人們食用的肉、奶、蛋、水產品、蔬菜以及冷凍食品等均有不同程度的污染，世界衛生組織(WHO)在關于單增李斯特菌食物中毒的報告中指出：4％～8％的水產品、5％～10％的奶及奶制品、15％以上的家禽、30％以上的肉制品及冷凍制品，均被該菌污染.食品中存在的單增李斯特菌對人類的食品安全存在較大威脅，是冷凍食品中威脅人類健康的主要病原菌之一。在美國李斯特菌被列為7種主要的食源性致死病菌之一，已經被WHO食品安全工作計劃列為重點檢測的食源性病菌之一。

單增李斯特菌是典型的胞內寄生菌，可在巨噬細胞和許多非吞噬細胞(如內皮細胞、上皮細胞和肝細胞)內增殖。單增李斯特菌的致病性涉及多個毒力因子，如內化素、溶血素、p60蛋白等。p60蛋白是李斯特菌分泌的一種具有高免疫原性的胞壁質水解酶，由iap基因編碼，相對分子質量約為60?000。p60蛋白由484個氨基酸殘基組成，N2末端有27個氨基酸殘基組成的信號肽序列，為李斯特菌屬各個種所共有，但其序列又具有特異性。對李斯特菌的iap基因進行測序后發現，其兩端為保守區域，中間為可變區域。根據上述保守區和可變區序列建立的PCR方法能夠用于李斯特菌的種、屬鑒定。有研究表明，在對單增李斯特菌的保護性免疫中.P60蛋白也是一個重要的抗原成分，它是刺激機體T細胞和B細胞產生免疫反應的主要抗原分子.

單增李斯特菌為需氧或兼性厭氧菌，生長溫度為1～45℃，對不利環境具有比較強的耐受能力，在4℃冰箱中也可生長繁殖，在pH5.0～9.0的環境中，1年后仍可檢出。這使其危害性更進一步增大。另外，單增李斯特菌病原體是定居在細胞內的，因此應用抗生素治療李斯特菌病的效果不太理想。由李斯特菌引起的疾病及其食源性感染日益引起世界各國的重視。對該病原進行快速、靈敏、準確的檢測是有效防治本病和保證食品衛生安全的重要手段.有研究表明在對單增李斯特菌的保護性免疫中p60蛋白也是一個重要的抗原成分，它是刺激機體B細胞和T細胞產生免疫反應的主要抗原分子。本研究對單增李斯特菌iap基因進行了原核表達、對表達產物的抗原反應性以及可溶性進行了分析，為今后進一步研究單增李斯特菌疫苗奠定了基礎。

本研究旨在克隆和表達單增李斯特菌的iap基因，研制基于p60蛋白的診斷用抗原和單克隆抗體，以對單增李斯特菌進行檢驗分析及制備基因工程疫苗奠定基礎。2003年，Jung和Frank等用inlAB的基因序列設計引物，PCR方法檢測分屬不同血清型的51份李斯特菌培養物，檢測限可達10cfu/ml。ActA蛋白由actA基因編碼的639個氨基酸組成，成熟的蛋白為610個氨基酸，分為3個結構域，有研究成功地在大腸桿菌中表達了actA基因，并研制出ActA單克隆抗體。區燕宜等對單核細胞增生性李斯特菌iap基因的進行原核表達，表達產物相對分子量60?000，以可溶性形式存在。