[發明專利]一種鑒定鰱魚幼苗性別的分子生物學方法

無效

• 申請號: 200910064285.4
• 申請日: 2009-02-27
• 公開（公告）號: CN101613750A
• 公開（公告）日: 2009-12-30
• 發明（設計）人: 常重杰;陳建軍;杜啟艷;夏曉華;王友利
• 申請（專利權）人: 河南師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 新鄉市平原專利有限責任公司
• 代理人: 毋致善

技術領域：

本發明涉及一種分子生物學，特別是一種鑒定鰱魚幼苗性別的分子生物學方法。

背景技術：

我國有著豐富的魚類資源，其中許多魚類在生長速率上存在著性別差異，因此，開展這些魚類性別決定相關基因及性別特異標記的研究對于魚類性別控制具有很高的理論指導意義。鰱魚(Hypophthalmichthys?molitrix)又叫白鰱、水鰱、跳鰱、鰱子，屬于鯉形目，鯉科，是著名的四大家魚之一。著名的特產經濟魚類，養殖歷史悠久，在我國池塘、湖泊、水庫均有養殖，且養殖產量一直居我國淡水養殖之首。鰱魚雌性生長發育快，生長迅速。目前人工雌核發育與激素性反轉結合創造全雌性的養殖群體是鰱魚育種的主要方向。但是由于鰱第一次性成熟需3～4年，在幼苗時期根本無法通過外觀形態來判斷其性別特征，所以怎樣從幼苗群體中，簡單快速的識別出遺傳性別成為制約鰱魚成功選育的先決條件。

RAPD技術是近幾年出現的，可以快速尋找分子標記的一種有效方法。用它在某些動物的基因組中尋找性別標記已有成功報道。如在虹鱒魚基因組中找到了兩個雄性特異的分子標記，可以作為識別雌雄的探針。Kovacs等2000年用RAPD掃描非洲鯰魚(Clarias?gariepinus)雌、雄基因池，找到兩個雄性性別相關的RAPD標記。

發明內容：

本發明的目的是提供一對鰱魚雄性特異性引物序列和一對對照管家基因引物序列。

本發明的另外一個目的是提供一種能快速鑒別鰱魚幼苗性別的方法。

本發明的技術方案是，鰱魚DNA分子鑒定性別的特異性片段，其特征在于：該特別片斷的序列命名為Hmmf。鰱魚幼苗DNA分子鑒別的雄性特異引物，其特征在于：該引物是由Hmmf序列設計合成的，該引物序列命名為Hmmf1和Hmmf2，對照管家基因引物是通過在NCBI網絡搜索到的鰱魚管家基因GAPDH設計合成的，其引物序列命名為Gapdh1和Gapdh2。一種鑒定鰱魚幼苗性別的分子生物學方法，其特征在于：利用設計的特異引物Hmmf1和Hmmf2，以及對照管家基因GAPDH的引物Gapdh1和Gapdh2，以鰱魚個體基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系為25μl，反應組成為1U的Taq?DNA聚合酶，2μl的dNTP，100～200ng基因組DNA，其中含雄性特異上下游引物及管家基因上下游引物各0.1μmol/L，在PCR儀上按下面的循環參數進行PCR擴增：95℃預變性5min后，94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸60sec共30個循環，最后72℃延伸10min，擴增產物以1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，在凝膠成像系統下觀察并拍照記錄，100bp?DNA?ladder作分子量標記，該方法中對照管家基因GAPDH的擴增帶在雌雄個體中均穩定存在，出現大小為800bp目的條帶的是雄性個體，沒有條帶的即為雌性個體。本發明與現有技術比較具有能對鰱魚幼苗進行性別鑒定且鑒別準確率高的顯著優點。

附圖說明：

圖1為利用特異PCR法對性別特異片段的驗證結果。在雌雄10個個體中，對照管家基因條帶在所有個體中清晰可見，證明PCR擴增程序沒有問題。1，2，3，4，5泳道都出現了大小為800bp的擴增帶，均為雄性個體；而6，7，8，9，10除管家基因外沒有擴增出任何條帶，均為雌性個體。M為100bp梯度的DNA分子量標準。箭頭1所指為大小為800bp的雄性特異條帶；箭頭2所指為對照基因條帶。

圖2為利用雄性特異引物和管家基因引物的鰱魚幼苗性別鑒定結果。隨機選取13個鰱魚幼苗個體進行性別鑒定。其中1，2，3，4，5，9，10，11八個個體的電泳帶上有一個800bp大小的條帶，為雄性個體；6，7，8，11，12五個個體在800bp位置上沒有條帶，為雌性個體。但管家基因條帶在雌雄個體中都出現。M為100bp梯度的DNA分子量標準。箭頭1所指為大小為800bp的雄性特異條帶；箭頭2所指為管家基因條帶。

具體實施方式：

雄性特異引物的獲得以及性別特異性的驗證