[發明專利]草魚呼腸孤病毒逆轉錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法

無效

• 申請號: 200910063047.1
• 申請日: 2009-07-07
• 公開（公告）號: CN101629216A
• 公開（公告）日: 2010-01-20
• 發明（設計）人: 方勤;張嵐嵐;丁清泉
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司
• 代理人: 王守仁

技術領域

本發明涉及病毒學領域，特別是一種草魚呼腸孤病毒(Grass?carp?reovirus，縮寫GCRV，又稱草魚出血病病毒Grass?carp?hemorrhagic?virus，縮寫GCHV)逆轉錄聚合酶鏈式反應(簡稱RT-PCR)的核酸檢測方法。本發明是基于草魚呼腸孤病毒湖南邵陽株GCRV873(又稱草魚出血病病毒湖南邵陽株GCHV873)的研究成果，該毒株已由中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期是2004年7月23日，保藏編號是CCTCC?NO：V200414。

背景技術

水生動物病毒病是嚴重危害水產養殖及疾病傳播的主要病原。隨著水產集約化養殖業的迅速發展，病毒性流行病頻頻發生，這些疾病在世界范圍內對水產養殖造成了極大的危害。GCRV隸屬于呼腸孤病毒科水生動物呼腸孤病毒屬，該病原曾一度引起我國長江中下游地區淡水養殖區大規模暴發草魚流行性出血病，造成嚴重的經濟損失。GCRV形態結構為二十面體對稱的無包膜球形顆粒，基因組由11條(S1-S11)分段的雙鏈RNA組成。

研究病原及其診斷手段，是預防病毒病發生與蔓延的重要環節。此外，隨著國際間魚苗、魚卵以及魚制品進出口的日益增多，由于檢疫制度的不完善，水生動物呼腸孤病毒病也隨之在世界各地傳播開來。為規范與杜絕外來帶毒水生生物苗種進入我國及我國帶毒苗種的出境，制定有效的診斷與預防措施十分必要。

目前在GCRV病原檢測方面雖有ELISA等血清學檢測方法，也有RT-PCR相關檢測方法的報道，但是現有的檢測手段都存在耗時較長(通常需要12小時以上)，且靈敏度與特異性欠佳等弊端，適應不了臨床檢測準確、快速、靈敏的要求。基于GCRV?s10基因片段編碼病毒外衣殼蛋白及宿主特異性強等特性，為此，我們建立了快速檢測GCRV感染細胞或患病草魚組織的RT-PCR核酸檢測方法。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：提供一種用于快速靈敏檢測編碼GCRV外衣殼蛋白VP7的s10基因的RT-PCR核酸檢測方法。GCRV?VP7蛋白為組成病毒的外衣殼組分，在病毒進入細胞過程中具有十分重要的作用，其編碼基因s10是病毒基因組核酸的重要組成部分。在草魚育種期、魚苗的出入境檢疫及草魚出血病流行期間對s10基因進行快速檢測，將為防治出血病的發生與蔓延、杜絕外來病毒的侵害以及防止帶毒魚苗的傳播提供標準的檢測方法。

本發明解決其技術問題采用以下的技術方案：

本發明提供的草魚呼腸孤病毒逆轉錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法，該方法是：采用RNA吸附柱離心法直接提取待測樣品中總RNA，通過逆轉錄酶鏈式反應從待測樣品中檢測編碼GCRV外衣殼結構蛋白VP7的s10基因片段；所述待測樣品包括正常細胞和病毒感染的細胞，及正常魚組織和病魚組織。

上述的檢測方法包括以下步驟：

(1)取少許細胞或魚體組織作為待測樣品，將所述待測樣品研磨凍融后進行離心沉淀，采用蛋白酶K和SDS對待測樣品進行處理，然后用RNA吸附離心柱對蛋白酶K和SDS處理的待測樣品RNA進行抽提。由此獲得待測的RNA樣品。

(2)根據GCRV?s10基因片段序列，分別設計用于RT-PCR擴增的特異性正反向引物，采用Superscript?II逆轉錄酶系統與高保真Taq酶，及s10基因片段特異引物序列進行s10基因片段的RT-PCR核酸擴增。

(3)采用所建立的RT-PCR方法，進行擴增產物的靈敏度測定與特異性分析。

本發明可以由以下方法得到上述的待測樣品：

(1)取0.5～1ml?GCRV待測樣品進行研磨，制成待測勻漿液；

(2)對于待測魚體組織樣品，按1∶3重量體積比加入1xPBS，進行待測樣品研磨，研磨的待測樣品重復凍融3次，即在-20℃低溫冰箱中快速結凍，然后取出于37℃快速解凍，得到待測勻漿液；

(3)將上述待測勻漿液通過離心得到沉淀物，該沉淀物為所述待測材料。

所述待測勻漿液可由離心機以12500g離心5分鐘得到沉淀物，在該沉淀物中加入150～200μl的pH值為8.0的TE，TE用DEPC處理的去離子水配置，高壓滅菌，然后依次加入蛋白酶K和SDS，使其終濃度分別為100μg/ml和0.5％；經充分混勻后，于60～68℃水浴孵育1h，以進行細胞裂解；再用RNA吸附柱離心法獲得RNA提取物，用于后續RT-PCR擴增。

本發明可以采用以下方法進行后續RT-PCR擴增，其步驟包括：

(1)根據GCRV?s10基因序列設計引物，GenBank序列號為AF403396；