[發明專利]草魚呼腸孤病毒逆轉錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法

無效

• 申請號: 200910063047.1
• 申請日: 2009-07-07
• 公開（公告）號: CN101629216A
• 公開（公告）日: 2010-01-20
• 發明（設計）人: 方勤;張嵐嵐;丁清泉
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢病毒研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司
• 代理人: 王守仁

1.一種草魚呼腸孤病毒核酸檢測方法，其特征是一種草魚呼腸孤病毒逆轉錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法，該方法是采用RNA吸附柱離心法直接提取待測樣品中總RNA，通過逆轉錄酶鏈式反應從待測樣品中檢測編碼GCRV外衣殼結構蛋白VP7的s10基因片段；所述待測樣品包括正常細胞和病毒感染的細胞，及正常魚組織和病魚組織。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征是該方法包括以下步驟：

(1)將所述待測樣品研磨凍融后進行離心沉淀，

(2)在上述離心沉淀的溶液中加入蛋白酶K及SDS進行細胞裂解，通過RNA吸附柱進行待測樣品總RNA的分離，

(3)采用Superscript?II逆轉錄酶系統與高保真Taq酶，及s10基因片段特異引物序列進行s10基因片段的RT-PCR核酸擴增。

3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征是所述待測樣品由以下方法得到：

(1)取0.5～1ml待測樣品進行研磨，制成待測勻漿液；

(2)對于待測魚體組織樣品，按1∶3重量體積比加入1xPBS，進行待測樣品研磨，研磨的待測樣品重復凍融3次，即在-20℃低溫冰箱中快速結凍，然后取出于37℃快速解凍，得到待測勻漿液；

(3)將上述待測勻漿液通過離心得到沉淀物，該沉淀物為所述待測材料。

4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征是在步驟(3)中：所述待測勻漿液由離心機以12500g離心5分鐘得到沉淀物，在該沉淀物中加入150～200μl的pH值為8.0的TE，TE用DEPC處理的去離子水配置，高壓滅菌，然后依次加入蛋白酶K和SDS，使其終濃度分別為100μg/ml和0.5％；經充分混勻后，于60～68℃水浴孵育1h；再用RNA吸附柱離心法獲得RNA提取物，用于后續RT-PCR擴增。

5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征是采用以下方法進行后續RT-PCR擴增，其步驟包括：

(1)根據GCRV?s10基因序列設計引物，GenBank序列號為AF403396；

(2)RT反應或cDNA合成：采用s10基因反向特異引物與待測RNA樣品混合，65℃反應5分鐘后立即放置冰上，然后在20μl反應體積依次加入變性的RNA模板引物混合物，5×RT?Buffer，10mMdNTP混合物，10U/μl的RNase?Inhibitor，200U/μl的逆轉錄酶1μl；于42℃保溫30min，進行cDNA第一鏈的合成，cDNA產物置-20℃保存備用；取2μl?cDNA產物為模板，用GCRV?s10基因序列正反向特異引物進行PCR擴增。

6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征是所述GCRV?s10基因序列的正反向特異引物的序列是：

正向引物的序列：5’-TCTAAGGATATCGTCGAACTTC-3’

反向引物的序列：5’-GATGAAACGAGAGACCCCTAC-3’。

7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征是用GCRV?s10基因序列的正反向特異引物擴增RT-PCR的產物大小為515bp，該產物通過1％瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

8.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征是RT-PCR擴增產物的陽性對照物為GCRV873，GCRV873是草魚呼腸孤病毒湖南邵陽株。

9.根據權利要求1至權利要求8中任一權利要求所述檢測方法的用途，其特征是該檢測方法用于草魚出血病的早期診斷或出入境水產品疫情的檢測。