[發明專利]5千億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉制備方法

有效

• 申請號: 200910062964.8
• 申請日: 2009-07-03
• 公開（公告）號: CN101619298A
• 公開（公告）日: 2010-01-06
• 發明（設計）人: 劉華梅;陳振民;李青;謝翔;楊克華;程治國;陳又香;繆華軍;余娜;王巧梅;黃志遠
• 申請（專利權）人: 武漢科諾生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及飼料工業和水體凈化劑一種枯草芽胞桿菌原藥(5,000億活芽胞/克)的制備方法，將在飼料工業和水產養殖方面上得到廣泛應用。隨著芽胞桿菌功能還在不斷地被發現，應用范圍也在不斷擴大，該產品將應用到如污染水體凈化、水果保鮮、垃圾除臭等新領域，在國內國際市場上有很強的競爭力。?

背景技術

自20世紀50年代以來，抗生素作為疾病治療劑和動物生長促進劑發揮了重大作用。然而，由于抗生素負面效果越來越嚴重，世界衛生組織已禁止在飼料中使用任何抗菌藥物，一些發達國家對獸用抗生素的使用也有明確規定。飼料和養殖業以添加抗生素預防和促進動物生長的飼養方式已經受到了很大沖擊，抗生素替代品的使用和推廣成為養殖業發展的必然方向。芽胞桿菌益生菌具備抗生素預防疾病和促進生長的特點，成為抗生素的替代品，將取得理想的應用效果，在養殖業中具有很大的開發潛力。?

益生菌又稱微生態制劑，是指有益微生物經過特殊馴化和加工制成的活菌制劑，益生菌可以改善動物腸道中微生物的菌群平衡，防治某些細菌性疾病的發生，能提高動物的飼料利用率、提高機體免疫力，促進生長和改善生產性能，得到安全無藥物殘留的動物產品。現已開發成商品制劑的益生菌有：芽胞桿菌類、酵母、乳酸菌、雙歧桿菌、鏈球菌、曲霉等，枯草芽胞桿菌(Bacillus?subtillus簡稱Bs)是最重要的品種。?

目前，國內芽胞桿菌益生菌制品的生成工藝主要有兩種，即固體發酵法和液體深層發酵法。固體發酵法是把益生菌接種到固體培養基上進行發酵培養，其優點是相對管理比較粗放，具有生產工藝簡單，投資少的特點，但同時具易受雜菌污染，菌體含量不易控制、產品質量不穩定的缺點。目前我國大多數芽胞桿菌益生菌產品都是采用該生產方法。液體深層發酵法是采用現代發酵技術，將益生菌菌種接種到反應器中進行通風培養，對整個發酵過程都可以進行精細的過程控制，具有便于無菌操作，容易控制菌體含量，產品質量穩定的特點，但技術水平要求較高，相對固體發酵投資要高，但更適合工業化生產。其一般工藝流程為：菌種接種培養→種子罐培養→發酵罐發酵培養→排放培養液→收集菌體→加入適量載體和保護劑→干燥→粉碎→過篩→稀釋混和→成品包裝→質檢→益生菌產品。?

國內通常采用的固體發酵方式生產的枯草桿菌制劑(有效活菌數一般在200億cfu/g左右)和部分廠家采用液體發酵生產的制劑(芽胞數一般為1000-2000億cfu/g)。?

發明內容

本發明的目的是在于提供了一種5千億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉制備方法，安全、高效優質，方法易行，由該工藝生產的枯草芽胞桿菌原藥中的活芽胞數達5,000億活芽胞/克。發明內容包括：安全的枯草芽孢桿菌益生菌的篩選；培養基優化及液體高密度補料發酵技術；高效的芽胞提取回收工藝；產品活芽胞數高。?

為了實現上述目的，本發明采用以下技術措施：?

1.Bs菌種的篩選：?

從全國各地不同土壤和水體中收集富含芽孢桿菌芽胞的土樣和水樣，將樣品用無菌水稀釋到100-200個芽胞/ml水，涂布在A₁分離培養基上，于29-31℃溫控培養箱中培養3-5d后，挑出芽胞同步率高的菌株，經革蘭氏染色后顯微鏡檢，選出具有Bs形態特征的菌株轉接到液體搖瓶發酵培養基中，29-31℃搖瓶培養后，選出生長迅速(發酵周期36小時以內)、生物量高(600nm可見光光密度OD₆₀₀≥70)的菌種KN-42轉接到試管斜面生長后于4℃保種。?

2.Bs菌種的確認：?

對KN-42菌株進行了形態和生理生化特征研究，測定KN-42菌株的16SrDNA共1421個有效堿基，根據枯草芽孢桿菌在Genebank中的16SrDNA序列進行分子鑒定，結合系統發育資料及分類資料(伯杰氏細菌手冊)鑒定KN-42菌株為枯草芽胞桿菌。KN-42菌株于2008年12月09日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC?NO.M208249。?

3.高產Bs的培養基優化：?