[發明專利]5千億活芽胞每克枯草芽胞桿菌原粉制備方法

有效

• 申請號: 200910062964.8
• 申請日: 2009-07-03
• 公開（公告）號: CN101619298A
• 公開（公告）日: 2010-01-06
• 發明（設計）人: 劉華梅;陳振民;李青;謝翔;楊克華;程治國;陳又香;繆華軍;余娜;王巧梅;黃志遠
• 申請（專利權）人: 武漢科諾生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

1.一種枯草芽胞桿菌，其特征在于：枯草芽胞桿菌KN-42(Bacillus?subtilis? KN-42)，保藏號為CCTCC?NO：M208249。

2.使用權利要求1所述的枯草芽孢桿菌制備枯草芽孢桿菌原藥的方法，其 步驟是：

A.將菌種KN-42轉接到試管斜面生長后于4℃保種；

B.對KN-42菌株進行了形態和生理生化特征研究，測定KN-42菌株的 16SrDNA共1421個有效堿基，根據枯草芽孢桿菌在Genebank中的16SrDNA序 列進行分子鑒定，結合系統發育資料及分類資料鑒定KN-42菌株為枯草芽胞桿 菌；

C.Bs的培養基：采用Box-Behken設計的響應面實驗，以芽胞數為篩選指 標，利用單因子實驗首先從碳源、氮源、微量元素因子中選擇因子篩選設計，采 用多元一次和二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系得到回歸方程， 通過對回歸方程來設計培養基B-49，芽胞數為70億cfu/ml；

(1)、碳源因子：通過單因子實驗，從玉米淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥 芽糖、甘露醇、大米粉、土豆淀粉、糊精、玉米粉中篩選出葡萄糖和玉米淀粉為 Bs碳源需求因子；

(2)、氮源因子：通過單因子實驗，從水解植物復合氨基酸、棉籽粉、豆粕、 花生粕、蛋白胨、酵母粉、玉米漿粉、玉米漿、魚粉、大豆蛋白、谷氨酸鈉、天 門冬氨酸、硫酸銨中篩選出蛋白胨、豆粕和玉米漿為Bs氮源需求因子；

(3)、微量元素因子：通過單因子實驗，從氯化鈷、碳酸鈣、硫酸鎂、磷酸 二氫鉀、氯化鈉、硫酸亞鐵、氯化錳、硫酸銅、硫酸鋅中篩選出磷酸二氫鉀和氯 化鈉為Bs微量元素需求因子；

(4)、利用PB實驗設計篩選Bs芽胞形成的因子，確定葡萄糖用量為14.42g/L， 玉米漿用量為18.61g/L，蛋白胨用量30.05g/L時Bs芽胞數，利用SAS軟件設計 中心組合實驗，得到Bs發酵配方B-49為：葡萄糖28.84g/L，玉米漿27.92g/L， 蛋白胨30.05g/L，豆粕3.88g/L，水解植物復合氨基酸3.91g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，氯化鈉3g/L；

D.高密度液體補料發酵技術提高發酵生物量：采用Box-Behken設計的響 應面實驗優化的培養基進行分批發酵，以發酵前期，對數期，穩定期OD、溶氧、 pH值、芽胞數為指標，確定營養平衡，及與芽胞數關系，在分批發酵配方上進 行碳源和氮源濃度加倍，采用糖濃度10g/ml，通過補加葡萄糖，使發酵過程還原 糖濃度為0.5-1.0％質量比，發酵過程共用葡萄糖7％質量比，發酵過程補加氨水， 使pH控制在6.8-7.2范圍，發酵液活芽胞數達100億/ml；

E.芽胞提取與回收工藝：發酵罐酸化：2N稀鹽酸，PH4.2，升溫35℃，80 目過濾，加3.18‰質量比硫酸鋅，攪拌3分鐘，再加2.27‰質量比黃血鹽，攪拌 1分鐘，靜置15分鐘，離心菌漿進行噴霧干燥，噴霧干燥進口風溫200℃，出 口風溫85-87℃，原粉活芽胞數達5,000億/克；

F.活芽胞數檢測：稱取0.99g～1.01g試樣到中性瓶中，加入100mL，0.85％ 質量比的生理鹽水，搖動混合均勻，再把混合瓶放在磁力攪拌器平臺上混合 30min后，放入超聲波水浴器中超聲15min，然后再放在勻質器中混合10min， 將處理的試樣溶液依次稀釋到10^-8放入70℃水浴鍋中水浴30min，然后稀釋到 10^-9取0.1mL到每個營養瓊脂培養基平板中，用涂棒把試樣溶液均勻涂布后，放 在37℃恒溫培養箱中培養16hr～20hr。