[發明專利]魔芋中芋花葉病毒分子快速檢測方法

無效

• 申請號: 200910060893.8
• 申請日: 2009-02-27
• 公開（公告）號: CN101492746A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 吳金平;胡曉;刁英;顧玉成;胡中立
• 申請（專利權）人: 武漢大學;湖北省農業科學院經濟作物研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于植物病蟲害檢疫領域，更具體涉及一種魔芋中芋花葉病毒(DsMV)分子快速檢測方法，利用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)分子生物學技術對魔芋中DsMV進行快速檢測。

背景技術

魔芋(Amorphophallus)屬天南星科魔芋屬多年生草本植物，也是我國貧困山區重要經濟作物之一。我國主要分布于湖北、云南、四川等長江流域。因魔芋地下球莖中含有葡甘露聚糖，目前廣泛用于食品、紡織印染、石油鉆探、制藥、日用化工等領域，有很好的經濟效益。但因常年無性繁殖，使病毒積累，種性退化，豐產性和品質無法保證。芋花葉病毒(dasheen?mosaic?virus，DsMV)是確定在天南星科植物上發生最普遍和危害最嚴重的病毒病原。Zettler等(1987)指出芋花葉病毒(DsMV)使天南星科Caladium、Dieffenbachia、Philodendron和Zant2edeschia等屬作物減產約60％。雖然相繼有多位學者對天南星科植物病毒病害進行了探索性研究，但由于該科植物本身材料的特點使研究相對難以深入。到目前為止，天南星科植物上鑒定和分離的病毒相對較少，而且該科植物侵染的病毒研究方法還局限于傳統生物學方法。近年來發展的反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法因其具有靈敏、快速、特異性強等優點，在植物病毒的檢測上顯示出強大的優勢。自1990年起，國內外已相繼用RT-PCR方法檢測了多種病毒，如：馬鈴薯Y病毒(PVY)，馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)，馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)等，但至今國內外至今未見有關魔芋中芋花葉病毒的報道。本發明通過合成一對擴增DsMV特異性外殼蛋白(cp)基因中間部分核心序列的寡核苷酸引物，利用RT-PCR技術建立了一種經濟簡便檢測魔芋中芋花葉病毒的方法。此方法將對魔芋脫毒苗的檢測和DsMV的控制起到重要作用。

發明內容

本發明目的是在于提供一種魔芋中芋花葉病毒分子快速檢測方法。該方法操作方便，經濟快速，且可100％檢測魔芋是否帶DsMV，從而為魔芋中DsMV的防治、脫毒苗的檢測提供有效手段。

為達到上述目的，本發明采用以下技術措施：

根據已報道的DsMV一對特異性外殼蛋白(cp)基因序列，首先合成1對擴增DsMV的cp基因中間部分核心序列的寡核苷酸引物；然后將提取的魔芋葉片的總RNA反轉成complement?DNA，再以complement?DNA為模板，結果擴增得到了與預期大小一致的0.35kb片段，接種DsMV后感病的魔芋也擴增到了此片段，而對照(清水和健康魔芋)中未擴增到任何產物。

一種魔芋中芋花葉病毒分子快速檢測方法，其步驟是：

A、依據陳集雙主編的《天南星科植物病毒的分子診斷和半夏研究》合成DsMV檢測的特異性引物DF：5′-GGG?CTT?GGG?TGA?TGA?TGG?A-3′，DR：5′-GCC?TTTCAG?TGT?TCT?CGC?TTG-3′，目的片段長度0.35kb；

B、用RNAprep?pure植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)提取帶芋花葉病毒的魔芋(dasheen?mosaic?virus，DsMV)葉片總RNA；

C、取一微量離心管，加入提取的RNA?8μL，10μM的oligo-d(T)4μL，72℃下變性5min，取出置于冰上放置5min，再依次加入：反轉錄酶緩沖液8μL，10mMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸4μL，40U/μL的RNA酶抑制劑1μL，20U/μL的反轉錄酶2μL，加入0.1％(V/V)焦碳酸二乙酯處理過的重蒸水15μL，將反應混合物于42℃PCR儀中延伸1h，-20℃保存備用

D、在12.5μLPCR反應體系中，取上述反轉錄產物complement?DNA?2μL，加10μM的引物DF和DR各1μL，10mMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸0.8μL，反轉錄酶緩沖液2μL，20mMol的氯化鎂0.7μL，2u/μl的Taq酶0.5μL，重蒸水4.5μL；反應條件是94℃預變性3min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環，最后再72℃延伸5min，在PCR儀上擴增，取擴增產物2.5μL進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統檢測到0.35kb片段長度條帶的為帶病毒植株，無條帶的為健康植株。