[發明專利]魔芋中芋花葉病毒分子快速檢測方法

無效

• 申請號: 200910060893.8
• 申請日: 2009-02-27
• 公開（公告）號: CN101492746A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 吳金平;胡曉;刁英;顧玉成;胡中立
• 申請（專利權）人: 武漢大學;湖北省農業科學院經濟作物研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

1、一種魔芋中芋花葉病毒分子快速檢測方法，其步驟是：

A、合成DsMV檢測的特異性引物DF：5′-GGG?CTT?GGG?TGA?TGA?TGG?A-3′，DR：5′-GCC?TTT?CAG?TGT?TCT?CGC?TTG-3′，目的片段長度0.35kb；

B、用RNAprep?pure植物總RNA提取試劑盒提取帶芋花葉病毒的魔芋葉片總RNA；

C、取一微量離心管，加入提取的RNA?8μL，10μM的oligo-d(T)4μL，72℃下變性5min，取出置于冰上放置5min，再依次加入：反轉錄酶緩沖液8μL，10mMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸4μL，40U/μL的RNA酶抑制劑1μL，20U/μL的反轉錄酶2μL，0.1％(V/V)焦碳酸二乙酯處理過的重蒸水15μL，將反應混合物于42℃?PCR儀中延伸1h，-20℃保存備用；

D、在12.5μLPCR反應體系中，取上述反轉錄產物complement?DNA?2μL，加10μM的引物DF和DR各1μL，10mMol的三磷酸堿基脫氧核苷酸0.8μL，反轉錄酶緩沖液2μL，20mMol的氯化鎂0.7μL，2u/μl的Taq酶0.5μL，重蒸水4.5μL；反應條件是94℃預變性3min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環，最后再72℃延伸5min，在PCR儀上擴增；

E、取擴增產物2.5μL進行瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統檢測到0.35kb片段長度條帶的為帶病毒植株，無條帶的為健康植株。