[發明專利]牛早期胚胎性別鑒定的分子生物學方法

無效

• 申請號: 200910060529.1
• 申請日: 2009-01-19
• 公開（公告）號: CN101475989A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 張淑君;楊利國;李翔;劉輝;劉文舉;胡修忠;易建明;吳俊靜;余勇
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于動物繁殖技術領域，具體涉及牛早期胚胎性別鑒定領域。

背景技術

為了充分發揮母畜的繁殖潛力和公畜的生長優勢，進而提高畜牧業的經濟效益.排除畜群中有害基因和基因型，防止性連鎖疾病。增加核心群選種中的選擇強度，提高優良畜群的繁殖速度，加快奶畜群的更新換代，人為控制家畜性別一直是人們追求的目標，特別是對于有經濟價值的家畜，如牛。對牛早期胚胎尤其是附植前胚胎進行性別鑒定，再進行移植，在生產中具有重要的科學研究價值和商業價值。因為牛繁殖周期長，繁殖速度慢，如能有效控制后代性別，不僅意味著經濟效益的增加，對促進優良母牛基因的推廣、加速品種改良有重要的意義。動物的某些生產性狀是受性別限制(泌乳等)或性別影響的(產肉、產毛等)，通過性別控制，達到理想的性別比例，可以獲得更多的所需性狀及更大的經濟效益。家畜胚胎的早期性別鑒定技術，是實現家畜性別控制的一種重要方法。通過移植已知性別的胚胎，控制家畜后代的性別，能加快優良母畜的繁殖速度，促進高效畜牧業的發展。這在養牛業上尤為重要。因為牛的妊娠期較長，人們渴望能夠在胚胎移植前對其進行性別鑒定，從而只移植所需性別的胚胎，節省不必要的時間和花費。

到目前，在牛繁殖生產中有實用價值的有2種途徑：①含X、Y染色體精子的分離技術，即通過X、Y精子微弱的生物學差異，分離出含兩種染色體的精子，用于人工授精或體外受精。流式細胞分離儀分離精子的準確率達到90％，但目前分離速度太慢(1.8×107個/h)，精液價格昂貴，且分離后精液不耐冷凍，后代有一定的畸形率，因而應用受到限制。②早期胚胎性別鑒定是在20世紀70年代中期，隨著胚胎移植的商業化出現的。回顧20多年的研究，核型分析、免疫學方法(H2Y抗原法)及生化方法(X2連接酶活力測定法)在應用于生產時都受到靈敏度、準確性、或所需時間等因素的限制。核型分析法準確率可達100％，但要獲得良好的細胞中期染色體擴散較難，鑒別時間也很長，胚胎可鑒別率較低；H2Y抗原是否為雄性特異性抗原尚有爭議；由于各種家畜早期雌性胚胎X染色體的失活與激活的確切時間還不清楚，因而降低了X2連接酶檢測法的準確率，且使用的染料影響胚胎的存活。而PCR法因其準確、快速、靈敏等優點，成為目前比較理想的胚胎性別鑒定方法。PCR法已經成功用于鑒別多種哺乳動物的胚胎性別，在養牛業應用的較多也較成熟。數以千計的現場牛胚胎性別鑒定結果表明PCR法性別鑒定較為實用(Shea，1999)，經得起生產考驗。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的缺陷，尋找一種可靠的用于牛早期胚胎性別鑒定的分子生物學方法。

實現本發明的技術方案是：

一種牛早期胚胎性別鑒定的分子生物學方法，采用巢式PCR方法，其步驟如下：

1、試樣的制備與保存

從待檢牛胚胎中分離4個或4個以上的細胞，用無菌超純水沖洗3次后，放入0.5mL?PCR管中，加入10μL無菌超純水，100℃煮沸10min～15min，立即置于碎冰中，冷卻后在8228×g?4℃離心5min，取上清液保存于4℃冰箱中備用；

2、引物設計

根據牛SRY基因序列(GeneBank登錄號：EU581861)，利用生物學引物設計軟件Primer3和PrimerPremier5，設計巢式PCR擴增引物。引物由上海生工生物工程技術有限公司合成。本發明設計了嵌套式內引物，并根據牛HBB基因(GeneBank登錄號：NC_007313)設計了兩對嵌套式引物作為內部對照，以確定PCR的有效性，防止假陰性結果的出現。

設計的引物序列如下：

SRY1(外引物)?????????正向：5’CTACTCCCCAACCGTCAGAAC3’；

?????????????????????反向：5’AGCCCAAACCCATCAACCTA3’；

SRY2(內引物)?????????正向：5’CCAGGGAACTGCTTGGGTA3’；

?????????????????????反向：5’TGCTTCTCCACTTAGGCTCAA3’；

HBB(內參照引物)??????正向：5’TATCCCACTTACAAGGCAGGTT3’；

?????????????????????反向：5’GCAGACAACAGAGAACAAGAATGA3’。

3、巢式PCR反應