[發(fā)明專利]牛早期胚胎性別鑒定的分子生物學方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910060529.1
• 申請日: 2009-01-19
• 公開（公告）號: CN101475989A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發(fā)明（設計）人: 張淑君;楊利國;李翔;劉輝;劉文舉;胡修忠;易建明;吳俊靜;余勇
• 申請（專利權）人: 華中農業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

1、一種用于牛早期胚胎性別鑒定的分子生物學方法，其特征在于下列步驟：

(1)試樣的制備與保存

從待檢牛胚胎中分離4個或4個以上的細胞，用無菌超純水沖洗3次后，放入0.5mL?PCR管中，加入10μL無菌超純水，100℃煮沸10min～15min，立即置于碎冰中，冷卻后在8228×g，4℃下離心5min，取上清液保存于4℃冰箱中，備用；

(2)巢式PCR反應

第一次PCR反應：以SRY1外引物和內參照HBB引物擴增，體系為20μL：0.8mmol/L的dNTP、2U的Taq?DNA聚合酶、0.2μmol/L的SRY基因外引物SRY1和內參照引物HBB、10×PCR緩沖液、2.5mmol/L的MgCl2，加適量雙蒸水；反應程序為95℃預變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，20個循環(huán)結束后，72℃再延伸10min，4℃保溫2min～10min；

第二次PCR反應，以SRY2外引物和內參照HBB引物擴增，取第1次PCR擴增產物8μL，作為第2次擴增模板，同時加入10×PCR緩沖液、2.5mmol/L的MgCl2、0.8mmol/L的dNTP1.6μL，2U的TaqDNA聚合酶、0.2μmol/L的SRY基因內引物SRY2和內參照引物HBB、適量的雙蒸水至20μL；反應程序為95℃預變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，34個循環(huán)后，72℃再延伸10min，4℃保溫2min～10min；

(3)PCR擴增產物檢測

取5μL?PCR擴增產物，1.0％～1.5％瓊脂糖凝膠電泳，所述的條件是：3V/cm～5V/cm，電泳20min～30min，用溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)檢查，得到電泳圖譜；

檢測電泳圖譜中是否同時出現(xiàn)558bp和219bp兩條帶；

其中，步驟(2)所用的特異引物如下：

SRY1外引物????正向：5′CTACTCCCCAACCGTCAGAAC3′；

??????????????反向：5′AGCCCAAACCCATCAACCTA3′；

SRY2內引物????正向：5′CCAGGGAACTGCTTGGGTA3′；

??????????????反向：5′TGCTTCTCCACTTAGGCTCAA3′；

HBB內參照引物?正向：5′TATCCCACTTACAAGGCAGGTT3′；

??????????????反向：5′GCAGACAACAGAGAACAAGAATGA3′。