[發明專利]牛精子克隆胚胎的方法

無效

• 申請號: 200910060523.4
• 申請日: 2009-01-15
• 公開（公告）號: CN101492669A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 楊利國;王滇;肖遙;張鑫;霍立軍
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/06
• 分類號: C12N15/06
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明涉及哺乳動物繁殖技術領域，具體涉及一種利用牛精子克隆胚胎的新方法。

背景技術

自成功利用體細胞核移植技術獲得成活的克隆羊[1]以來，多種哺乳動物甚至包括一些靈長類哺乳動物相繼克隆成功。盡管動物克隆技術存在效率低的問題[2]，但卻很好的證明了卵母細胞質和供體細胞核能夠支持整個胚胎發育過程。并且體細胞核移植技術在再生醫學、新藥物開發、動物育種等方面具有革命性的應用前景，故現在動物克隆技術仍是國內外的研究熱點。

然而，國內外有關動物生殖細胞克隆的研究相對較少。并且考慮到原生殖細胞處于基因組印記消除狀態，現今生殖細胞克隆技術一般僅局限于利用動物胚胎期的原生殖細胞進行克隆。Kato等選用妊娠期14.5-16.5天的小鼠胎兒原生殖細胞作為供體進行核移植，重構胚發育至妊娠期9.5天[3]。隨后，Lee等報道，利用妊娠期11.5-13.5天的原生殖細胞作為供體而生產的重構胚能發育至妊娠期11.5天[4]。在利用妊娠期10.5天的原生殖細胞進行克隆的嘗試失敗后[5]，Yamazaki等根據他們的研究結果推斷原生殖細胞并不適合作為核移植的供體。但同樣是用妊娠期10.5天的原生殖細胞作為供體進行核移植，Miki等卻成功的獲得具有生育能力的后代[6]，證明了原生殖細胞克隆是可以成功的。

目前，國內外尚無利用哺乳動物精子進行動物克隆的相關報道。理論上，精子克隆能夠使得后代中的遺傳物質幾乎全部來自于父本或母本，而且利用性控精液進行動物克隆還能控制后代性別。這些是生殖細胞克隆技術的誘人之處，但同時也有可能是該技術將面臨的挑戰。Surani等[7]和McGrath等[8]的研究表明，由于基因組印記的存在使得父源和母源基因組對小鼠的胚胎發育都是必需的。而Hoppe和Illmensee卻稱成功的生產出遺傳物質全部來自與父本或母本的單性生殖小鼠[9，10]。近來，Kono等也報道了孤雌生殖小鼠的誕生[11]，引起了世界性的關注。由此看來，精子克隆雖然在理論上可能存在挑戰，但這都是能夠克服的，況且小動物上的理論也不一定適用于大動物。

動物精子克隆技術的研究無論在科學機制探討上，還是在技術推廣應用上，都具有非常重大的意義和價值。首先，該技術是首次在哺乳動物去核的中期II卵母細胞中通過顯微操作注射進兩個精子。這兩個精子能否發生去致密而形成兩個雄原核，然后兩個雄原核相互融合并激發重構胚卵裂？兩套來自父本的基因組能否支持重構胚順利通過胚胎發育的早期阻滯，并發育至分娩，產下具有生育能力的后代？其次，在家畜動物精子克隆胚發育的整個過程中，重構胚的印記狀態具有什么樣的變化規律？這些問題都有待解決。再次，在動物育種技術的推廣方面，精子克隆比體細胞克隆具有更多優勢。種公畜的精子比種公畜的體細胞系更容易獲得、保存、運輸。精子克隆技術還可以選用來自兩個不同品系家畜的精子，從而加快家畜的品種改良。況且，性控精子克隆技術還能實現后代性別的控制。這些都是體細胞克隆所無法比擬的。最后，就像體細胞核移植技術成功用于轉基因動物的生產一樣[12-16]，精子克隆技術同樣也能應用于生產轉基因動物，甚至是轉基因性控動物，從而為轉基因動物生產開辟一條新道路。

發明內容

本發明的目的是利用牛的精子代替體細胞作為供體用于核移植，從而生產精子克隆胚利用牛卵細胞去核，利用精子在體外獲能，通過核移植方法生產獲得牛精子克隆胚胎。

本發明是這樣實現的：

一種牛精子克隆胚胎的方法，其步驟包括：

(1)將采集回的牛卵巢用磷酸緩沖液洗后將卵丘-卵母細胞復合體抽出，置于成熟培養液中進行體外培養，使所述的卵母細胞培養發育至第二次減數分裂中期，用透明質酸酶對卵丘-卵母細胞復合體脫顆粒細胞處理；

(2)先對步驟(1)的卵母細胞的細胞核染色，置于卵母細胞去核液中，再對細胞核進行熒光定位，準確吸取所述的細胞核，得到去核的牛卵母細胞；

(3)采集同一頭優秀種公牛的精液，或采集同一品種的不同個體的兩頭優秀種公牛的精液，或采集不同品種的兩頭優秀種公牛的精液，或購買性控優秀種公牛的商用精液，將所述的種公牛精液置液氮罐中貯存備用；

(4)將所述的種公牛精液在37℃下解凍，用精子獲能液使所述的精子獲能，置于卵母細胞注射液中備用；

(5)用顯微操作針一次性將步驟(4)所述的兩個獲能精子注入去核牛卵母細胞的胞質內，得到精子重構胚；

(6)將步驟(5)構建好的精子重構胚用激活培養基-1和激活培養基-2進行體外人工激活，使重構胚融合，然后，將激活后的精子重構胚置于胚胎培養液中培養；