[發明專利]牛精子克隆胚胎的方法

無效

• 申請號: 200910060523.4
• 申請日: 2009-01-15
• 公開（公告）號: CN101492669A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 楊利國;王滇;肖遙;張鑫;霍立軍
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/06
• 分類號: C12N15/06
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

1.牛精子克隆胚胎的方法，其步驟包括：

(1)將采集回的牛卵巢用磷酸緩沖液洗后將卵丘-卵母細胞復合體抽出，置于成熟培養液中進行體外培養，使所述的卵母細胞培養發育至第二次減數分裂中期，用透明質酸酶對卵丘-卵母細胞復合體脫顆粒細胞處理；

(2)先對步驟(1)的卵母細胞的細胞核染色，置于卵母細胞去核液中，再對細胞核進行熒光定位，準確吸取所述的細胞核，得到去核的牛卵母細胞；

(3)采集同一頭優秀種公牛的精液，或采集同一品種的不同個體的兩頭優秀種公牛的精液，或采集不同品種的兩頭優秀種公牛的精液，或購買性控優秀種公牛的商用精液，將所述的種公牛精液置液氮罐中貯存備用；

(4)將所述的種公牛精液在37℃下解凍，用精子獲能液使所述的精子獲能，置于卵母細胞注射液中備用；

(5)用顯微操作針一次性將兩個由步驟(4)獲得的獲能精子注入去核牛卵母細胞的胞質內，得到精子重構胚；

(6)將步驟(5)構建好的精子重構胚用激活培養基-1和激活培養基-2進行體外人工激活，使重構胚融合，然后，將激活后的精子重構胚置于胚胎培養液中培養；

其中：

步驟(1)的成熟培養液組分及配比如下：

以TCM-199商品培養基為基本培養基，附加胎牛血清10％，乙基哌嗪乙磺酸25mmol，丙酮酸鈉0.55mg/mL，青霉素100IU/mL，鏈霉素100IU/mL，促卵泡素0.1IU/mL、促黃體素0.1IU/mL、雌激素1μg/mL、表皮生長因子100ng/mL，調pH至7.0-7.2；

步驟(1)的磷酸緩沖液組分及配比如下：氯化鈉8.0g/L+氯化鉀0.2g/L，磷酸氫鈉1.15g/L，磷酸二氫鉀0.2g/L，調pH至7.0-7.2；

步驟(2)的卵母細胞去核液：基礎液為成熟培養液，添加5μg/mL細胞松弛素B，以重量/體積計的10％聚乙烯吡咯烷酮；

步驟(4)的精子獲能液：BO基礎液+6mg/mL牛血清白蛋白，5mM咖啡因，60ug/mL肝素；

步驟(4)的卵母細胞注射液：基礎液為步驟(1)的成熟培養液，添加按重量/體積計的10％聚乙烯吡咯烷酮；

步驟(6)的激活培養基-1和激活培養基-2的組分及配比如下：

激活培養基-1：

基礎液為成熟培養液附加離子霉素5μmol/L，調pH至7.0-7.2；

激活培養基-2：

基礎液為成熟培養液附加二甲基氨基嘌呤2mmol/L，調pH至7.0-7.2；

步驟(6)的胚胎培養液組分及配比如下：

氯化鈉107.63mmol/L，氯化鉀7.16mmol/L，磷酸二氫鉀1.19mmol/L，硫酸鎂1.51mmol/L，青霉素鈉0.012g/L，硫酸鏈霉素50μg/L，乳酸鈉5.35mmol/L，碳酸氫鈉25.00mmol/L，丙酮酸鈉7.27mmol/L，氯化鈣1.78mmol/L，肌醇2.77mmol/L，酚紅10.0μg/mL，枸杞酸鈉0.34mmol/L，必需氨基酸30.0μl/ml，非必需氨基酸10μl/mL，L-谷氨酰胺0.20mmol/L，牛血清白蛋白3mg/mL，調pH至7.0-7.2；

其中BO基礎液配方????????mg/100ml

NaCl????????????????????655.0；

KCl?????????????????????30.0；

CaCl₂·2H₂O?????????????33.0；

MgCl₂·6H₂O?????????????10.6；

NaH₂PO₄·2H₂O???????????12.98；

NaHCO₃??????????????????310.8；

葡萄糖??????????????????275.5；

丙酮酸鈉????????????????16.5；

青霉素??????????????????100IU/ml；

鏈霉素??????????????????100IU/ml；

補充六蒸水至100ml。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中注入牛卵母細胞的兩個精子來自同一個體種公牛。