[發明專利]一種甲狀腺球蛋白和紅蕓豆植物紅血球凝集素快速聯合純化方法

無效

• 申請號: 200910059300.6
• 申請日: 2009-05-15
• 公開（公告）號: CN101555277A
• 公開（公告）日: 2009-10-14
• 發明（設計）人: 張濤;何濤;楊雨晗;劉樺
• 申請（專利權）人: 成都醫學院
• 主分類號: C07K14/42
• 分類號: C07K14/42;C07K14/47;C07K1/14
• 代理公司: 北京律誠同業知識產權代理有限公司
• 代理人: 李高峽

1.一種分離純化紅蕓豆植物紅血球凝集素和甲狀腺球蛋白的方法，其特 征在于：它是將紅蕓豆中提取物植物紅血球凝集素粗提液與甲狀腺球蛋白粗提 液混合，采用共沉淀法提取、純化、分離，分別得紅血球凝集素單體和甲狀腺 球蛋白；包括如下步驟：

a、制備紅蕓豆植物紅血球凝集素粗提液；

b、制備甲狀腺球蛋白粗提液；

c、將紅蕓豆植物紅血球凝集素粗提液與甲狀腺球蛋白粗提液按體積比為： 0.5∶1-2∶1混合，離心，取沉淀；

d、沉淀溶解：將沉淀溶解于pH?3.0～pH?4.0，濃度為40mmol/L～60mmol/L 的甘氨酸-鹽酸緩沖液，并對緩沖液透析，將透析后的液體于低溫下離心，取 上清液；

e、純化：將上清液通過超濾、強酸型陽離子交換層析或者分子篩分離得 到植物紅血球凝集素單體和甲狀腺球蛋白；

其中，e步驟所述的超濾為：上清液加到20-50kD的超濾管中，離心，再 用純水進行脫鹽收集上清液和濾液，上清液凍干為甲狀腺球蛋白；再將濾液加 到5-15kD的超濾管中，離心，收集上清液，凍干為植物紅血球凝集素單體；

其中，e步驟所述離子交換是將上清液上柱吸附，用pH3.0～pH4.0，濃度 為40mmol/L～60mmol/L的甘氨酸-鹽酸緩沖液進行平衡至基線穩定，用含有 NaCl濃度為0-1mol/L，pH3.0～pH4.0，濃度為40mmol/L～60mmol/L的甘氨酸- 鹽酸的緩沖液進行梯度洗脫，流速為1ml/min，分別收集活性峰，裝入透析帶 中，低溫PEG濃縮，用純水透析除鹽后，分別凍干，即得到植物紅血球凝集素 單體和甲狀腺球蛋白；

其中，e步驟所述分子篩分離法是將上清液上柱吸附，用pH3.0～pH4.0，濃 度為40mmol/L～60mmol/L的甘氨酸-鹽酸緩沖液進行洗脫，流速為1ml/min，分 別收集活性峰，裝入透析帶中，低溫PEG濃縮，用純水透析除鹽后，分別凍干， 即得到植物紅血球凝集素單體和甲狀腺球蛋白。

2.根據權利要求1所述的分離純化紅蕓豆植物紅血球凝集素和甲狀腺球 蛋白的方法，其特征在于：a步驟所述的紅蕓豆植物紅血球凝集素粗提液的制 備方法為：稱取紅蕓豆，粉碎后過60目篩，加入8～10倍量的pH?4.0～pH?6.0， 濃度為15mmol/L～35mmol/L，含濃度為0.14mol/LNaCl的醋酸-醋酸鈉緩沖液， 浸泡過夜，用四層紗布過濾，收集濾液；將濾液在低溫離心，取上清液，向上 清液中加入硫酸銨固體粉末，使其終濃度25m/v％～32m/v％；低溫離心， 取上清液，即得植物紅血球凝集素粗提液。

3.根據權利要求1所述的分離純化紅蕓豆植物紅血球凝集素和甲狀腺球 蛋白的方法，其特征在于：b步驟所述的甲狀腺球蛋白粗提液的制備方法為： 取豬的新鮮甲狀腺去結締組織，稱重后，加入6～8倍量的pH?4.0～pH?6.0，濃 度為15mmol/L～35mmol/L，含濃度為0.14mol/LNaCl的醋酸-醋酸鈉緩沖液粉 碎，浸泡過夜，后用四層紗布過濾，收集濾液，低溫離心，取上清液，向上清 液中加入硫酸銨固體粉末，使其濃度為15m/v％-25m/v％低溫離心，取上清液， 即得甲狀腺球蛋白粗提液。

4.根據權利要求1所述的分離純化紅蕓豆植物紅血球凝集素和甲狀腺球 蛋白的方法，其特征在于：c步驟所述的紅蕓豆植物紅血球凝集素粗提液與甲 狀腺球蛋白粗提液的體積比為：1∶1。

5.根據權利要求1-4任意一項所述的分離純化紅蕓豆植物紅血球凝集素 和甲狀腺球蛋白的方法，其特征在于：所述的低溫是低于4℃。