[發明專利]一種α-氨基酸酯水解酶制備非均相生物催化劑的方法

有效

• 申請號: 200910058710.9
• 申請日: 2009-03-26
• 公開（公告）號: CN101845432A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 蔣寧;斯克利亞仁科·安娜;蔣用;庫偌什金娜·瓦連金娜;胡遠輝;薩塔偌娃·熱尼;王明蓉;克列斯季安洛瓦·伊琳娜;霍強;熊輝
• 申請（專利權）人: 中國醫藥集團總公司四川抗菌素工業研究所;俄羅斯聯邦國家科學中心工業微生物遺傳育種研究所
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08;C12R1/64
• 代理公司: 成都信博專利代理有限責任公司 51200
• 代理人: 陶紅

技術領域

本發明主要涉及氨基頭孢菌素和氨基青霉素酶法合成用的非均相生物催化劑的制備。

背景技術

α-氨基酸酯水解酶(AEHs)有兩種作用：一是催化水解α-氨基酸酯鍵及不同的頭孢菌素和青霉素類的酰胺鍵，二是利用α-氨基酸的酯化作用使7α-氨基頭孢烯和6α-氨基青霉烷的氨基發生N-酰化反應。相似的底物專屬性使得α-氨基酸酯水解酶可以作為生物催化劑用于合成那些側鏈α-位含有氨基的頭孢菌素和青霉素類(即氨基頭孢菌素和氨基青霉素)藥物。

對α-氨基酸酯水解酶結構的研究已經證明了這類酶屬于α/β折疊水解酶，其活性位點包含Ser-His-Asp三聯體結構。α-氨基酸酯水解酶與β-內酰胺酰化酶的主要區別在于其結構、活性位點、底物特異性和催化性能。例如，青霉素G酰化酶雖然可用于合成β-內酰胺類抗生素，但從結構上看則是屬于N末端水解酶，它含有N-末端殘基的β鏈，β鏈在催化反應中發揮親核作用。

從紅紋黃單胞菌(Xanthomonas?rubrilineans)中獲得的α-氨基酸酯水解酶可以作為催化合成氨基α-內酰胺類抗生素的生物催化劑[Pat.Russia?RU2221046(2004)；Kurochkina?V.B.，Nys?P.S.Antibiotics?and?chemotherapy(Russia)，No?8：6(1999)]。該文獻描述了從紅紋黃單胞菌中獲得的α-氨基酸酯水解酶的生物化學、物理化學及其催化性質[Krestyanova?I.N.，Uvarov?N.N.，Rudenskaya?G.N.et?al.Biochemistry(Russia)55(12)：2226(1990)；Blinkovsky?A.M.，Markaryan?A.N.Enzyme?Microb.Technol.15：965(1993)]。研究顯示此酶具有四個亞基的結構，并且亞基的分子量均為70000-72?000。

利用氨基酸酯水解酶開發酶法合成抗生素的方法需要對非均相生物催化劑進行技術創新，例如，以某種方式破壞生物細胞，提取酶并將其固定化的技術創新。

破壞含有氨基酸酯水解酶的紅紋黃單胞菌細胞的方法是以與水不混溶的乙酸丁酯來處理細胞。幾種處理方法的比較見表1。

表1用乙酸丁酯處理紅紋黃單胞菌破裂細胞的方法與α-氨基酸酯水解酶產出量比較

1#krestyanova?I.N.Biochemistfy(Russia)55(12)：2226(1990)；Zaslavskaya?P.L.et?al.Biotechnol.Appl.Biochem.18：299(1993).

2#Patent?Application?CN?200810044881.1；Patent?Application?RU2008107953.

無細胞提取液的酶比活性數值以毫克蛋白關聯的國際單位U表示。1酶活單位(U)的制劑等于在指定條件下，時長1分鐘時酶促轉化1umol底物或者形成1umol產物所需的酶量。

在各個例子中，所有的活性數據度均折算成頭孢氨芐合成時其水解酶和合成酶活性的實驗之比表示的活性。第一法[Krestyanova?I.N.，Uvarov?N.N.，Rudenskaya?G.N.et?al.Biochemistry(Russia)55(12)：2226(1990)；Zaslavskaya?P.L.，Chekalina?I.V.，Igans?D.N.et?al.Biotechnol.Appl.Biochem.18：299(1993)]不合任何預處理過程，活性收率不會高于90％，所產生的無細胞提取物液酶的比活性低于1U/mg蛋白。第二法[PatentApplication?CN?200810044881.1；Patent?Application?RU?2008107953]使用低溫效應預處理程序、細胞破碎的條件和酶提取終止點判據的選擇上與第一法不同。該法酶活性收率可達100％，所產生的無細胞提取液的酶比活為2.5-4.5U/mg蛋白。

最接近本發明制備胞內α-氨基酸酯水解酶的非均相生物催化劑的方法是來自紅紋黃單胞菌的酶制取生物催化劑的方法[Patent?Application?CN200810044881.1；Patent?Application?RU?2008107953]，可以作為相對于本發明的原型。原型方法代表了從生物細胞開始制備非均相生物催化劑的一個完整程序。

按照原型，制備非均相生物催化劑的方法構成如下：