[發明專利]一種制備肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶的方法

無效

• 申請號: 200910057924.4
• 申請日: 2009-09-22
• 公開（公告）號: CN102021161A
• 公開（公告）日: 2011-04-20
• 發明（設計）人: 黃青山;陸海榮
• 申請（專利權）人: 昆山博青生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/70;C12R1/19;C12R1/46
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及利用重組DNA技術生產蛋白質或多肽藥物領域，更具體的，本發明涉及大腸桿菌表達生產并純化肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶的方法。

背景技術

肺炎鏈球菌(Streptococcus?pneumoniae)是一種人類常見的和重要的病原體之一。肺炎鏈球菌可引起肺炎、敗血癥、腦膜炎、中耳炎、鼻炎等疾病。在耐藥性菌株日益加劇和疫苗療效不甚理想的情況下，肺炎鏈球菌造成了高發病率和死亡率，尤其是嬰幼兒，老年人和免疫功能低下患者。

噬菌體是一類專門侵染原核細胞的病毒，于1917年被發現。噬菌體寄生于細菌中，并在細菌中復制。在感染細菌的后期，噬菌體表達出細胞壁裂解酶，從而釋放出子代噬菌體，用于感染其它細菌。當這種裂解酶在細胞外部結合到細菌細胞壁時也能裂解細菌細胞壁上的肽聚糖，從而使細菌裂解死亡。噬菌體裂解酶在體外能高效、專一地殺死細菌，對感染細菌的模型動物有很好的治療作用。

噬菌體編碼的裂解酶主要有三種類型，分別為溶菌酶(肽聚糖上氨基糖之間的糖苷鍵)、酰胺酶(水解細菌細胞壁肽聚糖上糖與氨基酸間的酰胺鍵)和內肽酶(肽聚糖上肽交聯橋)。研究表明所有的噬菌體裂解酶在結構上具有相似性，即含有2個結構域：比較保守的N端催化區和差異較大的C端特異性結合區。裂解酶的高親和性與種屬特異的細胞壁糖基有關，而后者常常是細菌存活的必要成分，因而細菌難以產生對裂解酶的抗性。噬菌體裂解酶具有較高的特異性，僅攻擊特定細菌，因此該酶不影響無害或有益的人體寄生菌，也不影響其他細胞。所以，裂解酶作為新型抗菌藥物具有一定的優勢。

CPL-1是肺炎鏈球菌的噬菌體CP-1表達的裂解酶，于1987年由Jose?L.Garcia和Ernesto?Garcia首次在肺炎球菌噬菌體CP-1中克隆到(Jose?L.Garcia，Ernesto?Garcia，Ana?Arraras，et?al.Cloning，Purification，and?Biochemical?Characterization?of?the?Pneumococcal?Bacteriophage?Cp-1?Lysin[J].Journal?of?Virology，1987，61：2573-2580.)，該酶由339個氨基酸組成，其分子量為39KD，等電點4.62，含一對二硫鍵。CPL-1屬于糖基水解酶GH25家族，能特異性的裂解肺炎鏈球菌細胞壁肽聚糖的β1-4糖苷鍵。體外殺菌和感染細菌的動物模型方面的實驗證明其對肺炎球菌具有很強的抗菌活性(J.M.Entenza，J.M.Loeffler，D.Grandgirard，et?al.Therapeutic?Effects?of?Bacteriophage?CPL-1?Lysin?against?Streptococcus?pneumoniae?Endocarditis?in?Rats[J].Antimicrobial?Agents?and?Chemotherapy，2005，49：4789-4792)，基于其高效、專一的抗菌活性以及肺炎球菌耐藥性的日趨嚴重，將其開發成新型的抗菌藥物具有很好的應用前景，利用基因工程技術低成本、大規模制備噬菌體裂解酶也具有重要意義。

發明內容

本發明需要解決的技術問題是提供了一種大腸桿菌高效表達并純化重組CPL-1的方法。

本發明的發明構思是這樣的：

1987年Jose?L.Garcia等克隆表達的CPL-1方法是將肺炎球菌噬菌體CP-1中的CPL-1基因和CPL-1的啟動子一起克隆至大腸桿菌，但是表達效率并不高，因為原始CPL-1基因中有大約5％的大腸桿菌稀有密碼子，會直接影響到CPL-1在大腸桿菌中的表達。

本發明通過對編碼CPL-1的原始基因序列進行分析，發現其中有54個氨基酸(占總體的15.8％)的編碼子在大腸桿菌中使用頻率非常低，會嚴重影響該基因序列在大腸桿菌中的表達。因此本發明根據CPL-1的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏愛密碼子，人工設計合成了編碼CPL-1的基因序列SEQ.ID.NO：1。

本發明的技術方案是這樣的：

本發明提供了一種大腸桿菌表達肺炎鏈球菌噬菌體裂解酶CPL-1的方法，包括如下步驟：

(1)表達載體的構建：將編碼肺炎球菌噬菌體裂解酶CPL-1氨基酸序列的基因序列與啟動子相連；

(2)轉化大腸桿菌，使其含有步驟(1)所構建的載體，培養發酵；

(3)從發酵液中分離純化肺炎球菌噬菌體裂解酶CPL-1。

其中步驟(2)中噬菌體裂解酶CPL-1的表達為誘導表達。