[發(fā)明專利]結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體尾部蛋白的抗體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910057771.3
• 申請日: 2009-08-20
• 公開（公告）號: CN101993490A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡志能;楊揮
• 申請（專利權(quán)）人: 上海英伯肯醫(yī)學(xué)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;C12N5/20;C12N15/06;C12P21/08;G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 上海浦一知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31211
• 代理人: 王函

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種抗體，尤其涉及一種結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體尾部蛋白的抗體；此外，本發(fā)明還涉及該結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體尾部蛋白的抗體的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

肺結(jié)核病是由結(jié)核桿菌引起的一種人畜共患的慢性傳染病，是目前單一傳染性細(xì)菌致人死亡的主要因素。近年來，隨著艾滋病的流行、多種惡性腫瘤患者的增多以及多重抗藥性菌株的出現(xiàn)，更是增加了結(jié)核菌感染癥防治上的困難。統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全世界有結(jié)核病菌感染者20億(占總?cè)丝?/3)，每秒鐘感染一人，全球結(jié)核病菌每年新感染800萬人，如果不立即采取防擴(kuò)散措施，結(jié)核病將在今后10年內(nèi)奪去3000多萬人的生命。我國全國結(jié)核病感染者3.3億，結(jié)核病人600萬，每年因結(jié)核病死亡的病人高達(dá)25萬，為各類傳染病死亡總和的兩倍，因此我國已將結(jié)核病由丙類傳染病升為乙類傳染病，列入嚴(yán)格管理范疇。據(jù)WHO統(tǒng)計，全世界每年有5千萬至一億人感染結(jié)核，約三百萬人死于結(jié)核病，其中80％以上在發(fā)展中國家。因此，如何快速盡早地診斷并治療成為控制結(jié)核病擴(kuò)散和傳播的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前，肺結(jié)核的診斷除了一般胸部X光檢查外，主要是靠取痰液檢查，包括抗酸桿菌痰涂片染色鏡檢與結(jié)核桿菌培養(yǎng)，結(jié)核桿菌的細(xì)菌學(xué)檢查是確診肺結(jié)核的重要依據(jù)。抗酸桿菌涂片檢查敏感性低，特異性差，并且無法確定細(xì)菌死活。結(jié)核桿菌培養(yǎng)通常是將待檢標(biāo)本接種至改良的羅氏培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)20～60天，待細(xì)菌生長后再依據(jù)生物學(xué)特征及生化反應(yīng)多項指標(biāo)綜合判斷。由于結(jié)核菌的菌體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，富脂質(zhì)，疏水性，使得肺結(jié)核桿菌生長速度緩慢，每隔十二～二十四小時才分裂一次。所以，利用培養(yǎng)方法來偵測結(jié)核菌的存在，往往需要三～八周的時間才可以得到結(jié)果，耗費時間長，而且操作繁瑣，無法滿足快速確診肺結(jié)核的需要，經(jīng)常延誤治療的時機(jī)且敏感性不高(陽性率不過40％左右)。

最近幾年，噬菌體快速擴(kuò)增法利用恥垢分枝桿菌的快速生長特性以及D29噬菌體的相對專一性，進(jìn)行結(jié)核桿菌的快速檢測。該方法的核心內(nèi)容是：

a.用樣品處理液室溫處理待檢樣品30分鐘，離心去上清；

b.用增菌液37℃增菌24小時；

c.加入D29分枝桿菌噬菌體37℃溫育1小時，感染結(jié)核桿菌菌體；

d.用中止液滅活未侵入結(jié)核桿菌的噬菌體，室溫作用10分鐘以中止感染；

e.取步驟d所得的待測液，滴于恥垢分枝桿菌預(yù)包被的瓊脂菌落培養(yǎng)皿上，37℃溫育15-20小時；

f.根據(jù)菌落培養(yǎng)皿上噬菌斑的形成情況判定結(jié)果。

該方法的試劑盒特異性強(qiáng)、結(jié)果明晰，無需特殊儀器，可用于各種待檢樣品中活的結(jié)核桿菌菌體快速鑒定；但是整個測試至少需要48小時才能完成，而且操作較復(fù)雜，靈敏度也不夠高。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)、抗原純化技術(shù)及單克隆抗體技術(shù)的日益成熟，一些快速的檢驗方法相繼問世，如：聚合酶鏈反應(yīng)法(polymerase?chain?reaction，PCR)、酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA)、斑點免疫金滲濾法(dot?immuno-gold?filtration?assay，DIGFA)及免疫層析法(immunochromatographic?test，ICT)。

多聚酶鏈反應(yīng)是由一對特定的寡核苷酸引物介導(dǎo)待檢標(biāo)本中結(jié)核桿菌DNA特定序列片段的體外酶促擴(kuò)增技術(shù)，通過三個不同溫度、數(shù)十個變性、復(fù)性、延伸的循環(huán)，特定靶序列可被擴(kuò)增數(shù)百萬倍，而顯示其快速、高靈敏度、可定量分析以及理論上的高特異性等特點。不過該方法操作比較復(fù)雜，對操作設(shè)備和人員的技術(shù)要求較高，實驗室易產(chǎn)生污染。

酶聯(lián)免疫吸附法、斑點免疫金滲濾法和免疫層析法均是基于血清免疫學(xué)發(fā)展起來的檢測方法。這些方法均是以結(jié)核桿菌的特征性抗原為捕獲物，以標(biāo)記的抗人免疫球蛋白或葡萄球菌蛋白A(Staphylococal?Protein?A，SPA)等為指示系統(tǒng)，檢測患者體內(nèi)存在的抗結(jié)核分枝桿菌的循環(huán)抗體，間接地對病人的患病情況進(jìn)行診斷。酶標(biāo)法需要專業(yè)的儀器及高操作技能的專業(yè)人員。免疫滲濾法及免疫層析法均不需要任何儀器，檢測所需時間也大為縮短，操作簡便，結(jié)果直觀。但上述方法共同的問題是靈敏度以及特異性很難達(dá)到要求，并且不能區(qū)分曾經(jīng)感染已經(jīng)治愈的病例；有的產(chǎn)品甚至不能區(qū)分注射過卡介苗(Bacillus?Calmette-Guerin，BCG)的病例。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種結(jié)合結(jié)核桿菌噬菌體尾部蛋白的抗體。