[發明專利]改良裸鼠結腸癌原位移植瘤模型的構建方法

無效

• 申請號: 200910057431.0
• 申請日: 2009-06-17
• 公開（公告）號: CN101919747A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發明（設計）人: 張靜喆;楊海波;章學林;蔡駿;宋華榮;梁曉強
• 申請（專利權）人: 上海中醫藥大學附屬龍華醫院
• 主分類號: A61D7/00
• 分類號: A61D7/00
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司 31211
• 代理人: 潘詩孟

技術領域

本發明涉及醫學科研用的一種新的結腸癌移植瘤模型，是在裸鼠結腸癌原位移植瘤模型的基礎上改良而來。

背景技術

目前國內外腸道腫瘤的動物模型有：化學致癌物誘導法、腫瘤移植法和轉基因動物模型。

化學致癌物誘導法造模周期長，成功率低，目前已較少使用。

轉基因鼠成本高，品系少，在長期大規模試驗中應用有一定困難。

腫瘤移植法是目前最常用的方法。其優點是：使一群動物同時接種同樣量的瘤細胞，生長速率比較一致，個體差異較小，接種成活率近100％，對宿主的影響相類似，易于客觀判斷療效，可在同種或同品系動物中連續移植，長期保留供試驗用，試驗周期一般均較短，試驗條件易于控制等。腫瘤移植法又包括皮下移植瘤法、腹水瘤法、原位移植法等。原位移植因為可以提供給被移植物類似于人體的微環境，所以近年來得到廣泛應用。目前裸鼠結腸癌原位移植瘤模型國內外均可見報道。但在我們的研究過程中，發現了該模型的一些缺點：瘤體生長過快，容易形成消化道的梗阻，導致試驗動物死亡，試驗周期內試驗動物的死亡率過高(見圖2)。

本發明在實驗過程中巧妙地使用了一種新方法，將移植瘤塊移植到結腸系膜內血管旁，成功地建立了改良裸鼠結腸癌原位移植瘤模型。

發明內容

針對現有技術的上述不足，本發明所要解決的技術問題是提供一種方法簡單、能提供給被移植物類似于人體的微環境、不影響腫瘤的轉移途經、不易導致消化道梗阻、宿主存活率高的的結腸癌移植瘤模型。

為了解決上述技術問題，本發明提供的結腸癌移植瘤模型的構建包括如下步驟：

(1)瘤源的制備

將結腸腫瘤細胞培養、傳代后，用對數生長期的腫瘤細胞制備成單細胞懸液，調整細胞濃度至2×10⁷/ml；注射前用碘酊局部皮膚消毒，以0.1ml/只裸鼠，用無菌一次性注射器注入裸鼠右側腋下皮下；注射完畢后裸鼠自然進食；待瘤體直徑達1cm左右時，處死荷瘤鼠，消毒皮膚，切下瘤塊，去除壞死部分，選用淡黃色或呈魚肉狀瘤組織置于生理鹽水中，剪成直徑2mm的瘤塊備用；

(2)模型制作方法

造模裸鼠禁食4h，以0.5％戊巴比妥溶液35～50mg/kg體重腹腔注射麻醉；用碘酊消毒，取下腹正中或經右側腹直肌切口約2cm，逐層切開腹壁各層，以血管鉗牽開腹膜，辨認升結腸；在距回盲部2cm的升結腸系膜上沿結腸腸軸平行方向做一0.3～0.4cm切口，將已制備好的瘤塊2塊置于結腸系膜內血管附近，并用3-0絲線縫合腸系膜切口；常規縫合腹壁切口，麻醉清醒后自然進食；飲水中添加琥乙紅霉素1g/100ml；將裸鼠飼養于無菌層流室中，室溫控制在(25±1)℃，相對濕度40％～50％，連續觀察3周。

本發明將制備好的瘤塊移植于結腸系膜內血管附近，而非腸管的漿膜層。該方法建立了能重現人結腸癌自然臨床病理過程，短期內不會發生消化道管腔梗阻，且轉移模式與臨床患者相似的動物模型，使模型動物造模后的生存時間明顯延長。這對于抗腫瘤藥物的研發、尤其對中醫藥抗腫瘤藥物的篩選及作用機制的研究具有重要的現實意義。

本發明能實現類似于結腸癌原位移植瘤模型的目的，又能使在試驗過程中因消化道管腔梗阻發生的宿主死亡率明顯降低。本發明方法簡單，造模成功率高，實用性強，具有一定的經濟、實用價值。

附圖說明

圖1為本發明改良裸鼠結腸癌原位移植瘤模型的構建流程圖。

圖2是腫瘤結腸原位移植法構建的動物模型示意圖(圖中箭頭所示為壓迫腸道的移植瘤，可見腸道梗阻，梗阻近端腸管充氣擴張)。

圖3為本發明構建方法中移植瘤塊種植部位示意圖。

圖3中：(1)瘤塊種植部位；(2)結腸；(3)腸系膜前動靜脈分支；(4)腸系膜前動脈；(5)盲腸。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例應理解為僅用于說明本發明而不用于限制本發明的保護范圍。在閱讀了本發明記載的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發明權利要求所限定的范圍。

實施例1

1.材料和方法

1.1細胞株及試劑消化液(0.25％胰酶溶液+1mM?EDTA)、含10％胎牛血清的RPMI1640+雙抗培養液、PBS液、CO2培養箱、倒置顯微鏡、琥乙紅霉素片

1.2動物BALB/C裸鼠20只，SPF級，購自中科院，鼠齡6～8周，體重18～20g。隨機分為對照組10只、模型組10只。

2.動物模型的構建