[發明專利]一種解除銨阻遏的生物產氫基因工程菌及其構建方法

無效

• 申請號: 200910056799.5
• 申請日: 2009-08-21
• 公開（公告）號: CN101993849A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 周志華;李欣峰;劉通
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12Q1/04;C12P3/00;C12R1/01
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜;范征

技術領域

本發明屬于生物工程領域，更具體地，本發明涉及一種可以在高銨(銨離子)濃度下進行高效光合制氫的基因工程菌株及其構建方法。

背景技術

作為一種清潔能源載體，生物法制氫有著廣闊的發展前景。在各種生物法制氫的方式中，應用紫色非硫細菌(purple?non-sulfur?bacteria)如類球紅細菌(Rhodobacter?sphaeroides)進行光發酵制氫具有明顯的優勢。首先，紫色非硫細菌可以利用多種小分子有機物制氫，甚至包括暗發酵無法降解的乙酸，因此可以在制氫的同時處理發酵廢水。其次，紫色非硫細菌可以徹底降解有機物到二氧化碳，因此利用同樣的底物，它的理論產氫量大大高于暗發酵制氫。另外，利用光發酵產生的氫氣純度(75％-90％)比暗發酵的純度(40％-60％)高很多，這使得隨后的純化更容易。還有，這種制氫方式可以直接利用太陽能，而且不需要復雜的半導體太陽能板。以上的優勢使光發酵制氫成為應對化石能源危機和日益增長的有機廢物的可行方案之一。但光發酵制氫用于生產仍有一些問題有待解決。其中之一，就是如何解除銨對制氫的抑制。

紫色非硫細菌在光照下通過固氮酶催化產生氫氣。由于固氮酶的表達和活性會受到銨的嚴格控制，因此在有豐富氮源時無法產生氫氣。許多報道指出，在添加銨2-3分鐘后紫色非硫細菌的固氮酶就會被完全抑制，這種抑制完全解除需要將氮源消耗殆盡，往往是一個相當長的過程。有報道稱游離銨離子濃度達到14mM時類球紅細菌就會完全喪失產氫能力。在光發酵制氫的研究中，為了避免銨阻遏現象，通常使用谷氨酸作為制氫培養基的氮源。然而許多廢水中銨離子的濃度超過14mM。例如，味精廠廢水中銨離子的濃度為55-533mM，焦化廢水為200mM，化肥廠廢水中銨離子的濃度高達897mM。高濃度的銨離子會抑制紫色非硫細菌利用這些廢水中的有機物產氫。

為了解決光發酵制氫過程的銨阻遏，已有很多科學家作過嘗試。他們采用與其他厭氧微生物共培養或者兩步法先將培養基中的銨消耗掉然后進行制氫。例如，在含有2.1mM銨的豆腐廢水中，類球紅細菌與厭氧菌clostridiumbutyricum?IFO?3847共培養可以產生2.2mL氫氣/mL廢水，而單獨使用類球紅細菌時產氫量為1.9mL/mL廢水。Takabatake等人發現紫色非硫細菌經過96小時的生長后會消耗掉培養基中18mM的銨離子，然后開始產生氫氣。但在以上這些嘗試中，銨抑制解除效果并不十分明顯。

隨著對銨抑制機理的了解，科學家希望通過遺傳操作來獲得可以解除銨抑制的突變體。nifA基因編碼nif基因的特異性轉錄激活因子，它控制著固氮酶的合成。許多解除銨阻遏的遺傳改造與nifA的轉錄和活性有關。一株組成型過表達nifA的莢膜紅細菌突變體可以在15mM銨離子濃度下介導nif基因的轉錄。NtrB/NtrC在莢膜紅細菌中被證實是全局性調控nif基因的雙組分系統，PII蛋白介導該系統的激活。氮源缺乏條件下NtrB將調控因子NtrC磷酸化進而激活。相反，銨存在時，PII蛋白會介導NtrC的去磷酸化最終使nifA的轉錄終止。莢膜紅細菌的PII蛋白突變體在20mM銨離子濃度下保持高水平的產氫活力。突變株的固氮酶活是野生型的4倍，產氫也有1.5倍的增強。但同樣的類球紅細菌PII蛋白突變體在2mM銨離子濃度下只能產生野生型無銨條件氫氣量的1/6，還沒有試驗結果證實PII蛋白和NtrB/NtrC系統在類球紅細菌或其他光合細菌中也參與nif基因表達的全局性調控。因此，這些光合細菌需要更有效的方法解除銨阻遏。

綜上，本領域還有必要開發可徹底地解除銨阻遏的細菌，以高產地獲得氫能源。

發明內容

本發明的目的在于提供一種解除銨阻遏的生物產氫基因工程菌及其構建方法和應用。

在本發明的第一方面，提供一種解除銨阻遏的生物產氫基因工程菌，其不表達谷氨酰胺合成酶(GS)。

在一個優選例中，通過基因敲除的方法使所述的基因工程菌不表達谷氨酰胺合成酶。

在另一優選例中，所述的基因工程菌的基因組中，含有突變的glnA基因序列，其不編碼谷氨酰胺合成酶(即不表達谷氨酰胺合成酶)。

在另一優選例中，所述的突變的glnA基因序列為：內部插入了卡那霉素抗性基因序列的glnA基因序列。

在另一優選例中，所述的卡那霉素抗性基因序列插入在glnA基因序列的內部的stuI位點上。

在另一優選例中，所述的突變的glnA基因序列為：內部插入了氯霉素抗性基因或鏈霉素抗性基因序列glnA的基因序列。