[發明專利]一種解除銨阻遏的生物產氫基因工程菌及其構建方法

無效

• 申請號: 200910056799.5
• 申請日: 2009-08-21
• 公開（公告）號: CN101993849A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 周志華;李欣峰;劉通
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12Q1/04;C12P3/00;C12R1/01
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜;范征

1.一種解除銨阻遏的生物產氫基因工程菌，其不表達谷氨酰胺合成酶。

2.如權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌的基因組中，含有突變的glnA基因序列，其不編碼谷氨酰胺合成酶。

3.如權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的基因工程菌是紫色非硫細菌。

4.如權利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述的紫色非硫細菌選自：類球紅細菌(Rhodobacter?sphaeroides)、莢膜紅細菌(Rhodobacter?capsulutas)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum?rubrum)。

5.一種制備權利要求1所述的基因工程菌的方法，包括：

(1)提供一打靶質粒，所述的打靶質粒中，含有突變的glnA基因序列，其不編碼谷氨酰胺合成酶；

(2)將(1)所述的打靶質粒轉入紫色非硫細菌內，通過同源交換使得突變的glnA基因序列整合到紫色非硫細菌的基因組；和

(3)選擇發生了雙交換的紫色非硫細菌，即為權利要求1所述的基因工程菌。

6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，通過接合轉移的方法將打靶質粒轉入紫色非硫細菌內。

7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述選擇發生了雙交換的紫色非硫細菌的方法是：

(a)將待選擇的菌涂布到添加篩選培養基上，所述的培養基為RCVBN，其中以1.0-1.6g/L谷氨酰胺代替其中的硫酸銨；

(b)培養所述的菌，能夠在培養基上生長的菌即為發生了雙交換的紫色非硫細菌。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的篩選培養基含有：DL蘋果酸4g/L，磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀緩沖液10mM，七水硫酸鎂200mg/L，谷氨酰胺1.45g/L，二水氯化鈣75mg/L，乙二胺四乙酸鈉20mg/L，生物素0.01mg/L，維生素B10.5mg/L，尼克酸1mg/L，微量金屬元素貯液1mL/L，瓊脂粉20g/L。

9.一種利用高氨離子濃度的底物制備氫氣的方法，包括：在光照下，培養權利要求1所述的基因工程菌，收集所產生的氫氣。

10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，

光照強度為5000±2000lux；或

培養時，采用的底物選自：RCVBN培養基、生物乙醇廢水，琥珀酸廠廢水，豆制品廢水；或

底物中銨離子濃度為0-100mM。