[發(fā)明專(zhuān)利]亞硝酸鹽還原酶的制備方法及其酶制品

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910055120.0
• 申請(qǐng)日: 2009-07-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101597598A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-12-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龔鋼明;呂玉濤;管世敏
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/06
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/06;C12N9/96;A23K1/165;A23L1/015;A62D3/02;C12R1/25;C12R1/245;C12R1/225;C12R1/46;C12R1/01;A62D101/47
• 代理公司: 上海申匯專(zhuān)利代理有限公司
• 代理人: 吳寶根

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的分離純化方法，以及利用這種方法獲得的酶制劑。

背景技術(shù)

亞硝酸鹽是我國(guó)近年來(lái)食物中毒的主要化學(xué)致病因子之一。亞硝酸鹽被吸收進(jìn)入血液后，可使正常的血紅蛋白中Fe²⁺氧化成Fe³⁺，使血紅蛋白失去攜氧功能，出現(xiàn)組織缺氧，甚至導(dǎo)致缺氧窒息。亞硝酸鹽還是強(qiáng)致癌物亞硝胺的前體物質(zhì)，潛在著致癌危害。它與蛋白質(zhì)分解中間產(chǎn)物仲胺反應(yīng)形成亞硝胺，后者可誘發(fā)多種癌癥如肝癌、胃癌、食道癌和咽癌

目前，由于大量使用氮肥、以及一些地區(qū)使用工業(yè)廢水和生活污水灌溉，致使水中亞硝酸鹽污染嚴(yán)重；蔬菜、糧食、飼料中亞硝酸鹽超標(biāo)也較普遍。此外，傳統(tǒng)腌泡菜、各種肉灌腸中一直存在亞硝酸鹽超標(biāo)問(wèn)題。胡萍從1990至2003對(duì)我國(guó)21個(gè)省市共13013份市售肉制品檢樣發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽年均檢出率和超標(biāo)率竟達(dá)52.6％和26.2％。14年來(lái)各地平均檢出率和超標(biāo)率竟達(dá)61.4％和27.3％，總監(jiān)測(cè)不合格率接近30％。說(shuō)明我國(guó)肉制品中亞硝酸鹽殘留量維持在相當(dāng)高水平。肉制品中亞硝酸鹽的檢出與超標(biāo)涉及全國(guó)60％的省份。另一方面，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，癌癥高發(fā)區(qū)居民飲水中亞硝酸鹽含量高于低發(fā)區(qū)。

鑒于食物中亞硝酸鹽的危害嚴(yán)重，人們?cè)谂ふ医档褪称穪喯跛猁}的途徑。亞硝酸鹽還原酶是催化亞硝酸鹽還原的一類(lèi)酶，它能催化亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為NH4和H2O，因而也可用于分解食品中亞硝酸鹽。從食品安全角度出發(fā)，乳酸菌亞硝酸鹽還原酶在降低食品中亞硝酸鹽含量超標(biāo)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種乳酸菌亞硝酸鹽還原酶的分離純化方法，以及利用這種方法獲得的酶制劑，這種亞硝酸鹽還原酶制劑可用于除去食品、飼料和環(huán)境中的亞硝酸鹽殘留，提高食品安全質(zhì)量，以及預(yù)防亞硝酸鹽引起的食物中毒和癌癥等。

本發(fā)明技術(shù)方案：一種亞硝酸鹽還原酶的制備方法，包括下列步驟：

(1)將乳酸菌按2-5％接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，在25-30℃條件下培養(yǎng)20-24h得第一代菌種，再將一代菌種以2-5％接種量接到MRS培養(yǎng)基，在25-30℃培養(yǎng)20-24h得第二代菌種；

(2)將第二代菌種按照發(fā)酵培養(yǎng)基體積3％-8％接種量接到MRS發(fā)酵培養(yǎng)基，在25-30℃培養(yǎng)30-48h；

(3)將上述發(fā)酵液用1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6.2-6.4，按0.2--0.45mg/ml添加亞硝酸鈉溶液。30℃培養(yǎng)16--32h；

(4)將上述發(fā)酵液經(jīng)4000-8000r/min，4-10℃，離心5-20min收集沉淀，向沉淀中加入4-5倍體積的pH6.5～7.5的磷酸鹽緩沖液，待沉淀完全懸浮后在4-10℃、4000-8000r/min，離心5-20min，收集沉淀，并用相同方法重復(fù)兩次再收集沉淀；

(5)每50-100mg沉淀中加入1-5ml、pH6.5-7.5的磷酸鹽緩沖液，將發(fā)酵液沉淀完全懸浮，再每100ml懸浮液加入2ml-5ml，0.05g/ml的溶菌酶溶液，35-50℃，80-100r/m，搖床中處理10-15h，再用超聲波輔助破碎細(xì)胞，4-10℃，100-150W，5-10min，方式為工作2-5s，間歇2-5s，得到破碎細(xì)胞液，以3000-8000r/min，4-10℃離心5-30min，收集上清液；

(6)上清液用0.22-0.45um的微孔濾膜過(guò)濾，收集濾過(guò)液；

(7)將濾過(guò)液用葡聚糖凝膠層析柱分離，其中凝膠層析柱為G-75、G-100或G-150，用pH6.5-7.5磷酸鹽緩沖液洗脫，收集具有亞硝酸鹽還原酶活性的組分，將該組分裝入透析袋，4-10℃用PEG-20000處理24h即得到亞硝酸鹽還原酶。

其中，亞硝酸鹽還原酶活性檢測(cè)是：取一支小試管，裝入3-5ml的破碎細(xì)胞上清液的層析柱分離液，加入20-25ul亞硝酸鈉溶液(亞硝酸鈉溶液濃度為0.02g-0.05g/ml)，混勻，30℃反應(yīng)10-12h后檢測(cè)亞硝酸鈉含量變化，亞硝酸鈉含量降低20-100％為有活性組分。

亞硝酸鹽含量的測(cè)定方法采用GB/T?5009.33-2003中的鹽酸萘乙二胺法對(duì)亞硝酸鹽進(jìn)行檢測(cè)。

其中，溶菌酶活力為10000-20000u/mg