[發明專利]亞硝酸鹽還原酶的制備方法及其酶制品

無效

• 申請號: 200910055120.0
• 申請日: 2009-07-21
• 公開（公告）號: CN101597598A
• 公開（公告）日: 2009-12-09
• 發明（設計）人: 龔鋼明;呂玉濤;管世敏
• 申請（專利權）人: 上海應用技術學院
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N9/96;A23K1/165;A23L1/015;A62D3/02;C12R1/25;C12R1/245;C12R1/225;C12R1/46;C12R1/01;A62D101/47
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司
• 代理人: 吳寶根

1.一種亞硝酸鹽還原酶的制備方法，包括下列步驟：

(1)將乳酸菌按2-5％接種量接種于MRS培養基中，在25-30℃條件下培養20-24h得第一代菌種，再將一代菌種以2-5％接種量接到MRS培養基，在25-30℃培養20-24h得第二代菌種；

(2)將第二代菌種按照發酵培養基體積3％-8％接種量接到MRS發酵培養基，在25-30℃培養30-48h；

(3)將上述發酵液用1mol/L的氫氧化鈉調節pH值至6.2-6.4，按0.2--0.45mg/ml添加亞硝酸鈉溶液。30℃培養16--32h；

(4)將上述發酵液經4000-8000r/min，4-10℃，離心5-20min收集沉淀，向沉淀中加入4-5倍體積的pH6.5～7.5的磷酸鹽緩沖液，待沉淀完全懸浮后在4-10℃、4000-8000r/min，離心5-20min，收集沉淀，并用相同方法重復兩次再收集沉淀；

(5)每50-100mg沉淀中加入1-5ml、pH6.5-7.5的磷酸鹽緩沖液，將發酵液沉淀完全懸浮，再每100ml懸浮液加入2ml-5ml，0.05g/ml的溶菌酶溶液，35-50℃，80-100r/m，搖床中處理10-15h，再用超聲波輔助破碎細胞，4-10℃，100-150W，5-10min，方式為工作2-5s，間歇2-5s，得到破碎細胞液，以3000-8000r/min，4-10℃離心5-30min，收集上清液；

(6)上清液用0.22-0.45um的微孔濾膜過濾，收集濾過液；

(7)將濾過液用葡聚糖凝膠層析柱分離，其中凝膠層析柱為G-75、G-100或G-150，用pH6.5-7.5磷酸鹽緩沖液洗脫，收集具有亞硝酸鹽還原酶活性的組分，將該組分裝入透析袋，4-10℃用PEG-20000處理24h即得到亞硝酸鹽還原酶。

2.一種亞硝酸鹽還原酶制品，其特征在于通過下列步驟制備而得：

(1)將乳酸菌按2-5％接種量接種于MRS培養基中，在25-30℃條件下培養20-24h得第一代菌種，再將一代菌種以2-5％接種量接到MRS培養基，在25-30℃培養20-24h得第二代菌種；

(2)將第二代菌種按照發酵培養基體積3％-8％接種量接到MRS發酵培養基，在25-30℃培養30-48h；

(3)將上述發酵液用1mol/L的氫氧化鈉調節pH值至6.2-6.4，按0.2--0.45mg/ml添加亞硝酸鈉溶液。30℃培養16--32h；

(4)將上述發酵液經4000-8000r/min，4-10℃，離心5-20min收集沉淀，向沉淀中加入4-5倍體積的pH6.5～7.5的磷酸鹽緩沖液，待沉淀完全懸浮后在4-10℃、4000-8000r/min，離心5-20min，收集沉淀，并用相同方法重復兩次再收集沉淀；

(5)每50-100mg沉淀中加入1-5ml、pH6.5-7.5的磷酸鹽緩沖液，將發酵液沉淀完全懸浮，再每100ml懸浮液加入2ml-5ml，0.05g/ml的溶菌酶溶液，35-50℃，80-100r/m，搖床中處理10-15h，再用超聲波輔助破碎細胞，4-10℃，100-150W，5-10min，方式為工作2-5s，間歇2-5s，得到破碎細胞液，以3000-8000r/min，4-10℃離心5-30min，收集上清液；

(6)上清液用0.22-0.45um的微孔濾膜過濾，收集濾過液；

(7)將濾過液用葡聚糖凝膠層析柱分離，其中凝膠層析柱為G-75、G-100或G-150，用pH6.5-7.5磷酸鹽緩沖液洗脫，收集具有亞硝酸鹽還原酶活性的組分，將該組分裝入透析袋，4-10℃用PEG-20000處理24h即得到亞硝酸鹽還原酶；

(8)在所得沉淀中加入10-50％淀粉即得到所述酶制品。