[發明專利]一種生產重組高活性錳超氧化物歧化酶的方法

有效

• 申請號: 200910055002.X
• 申請日: 2009-07-17
• 公開（公告）號: CN101955918A
• 公開（公告）日: 2011-01-26
• 發明（設計）人: 李素霞;袁勤生;陳車生;吳梧桐
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12R1/19
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜;范征

技術領域

本發明屬于生物技術領域；更具體地，本發明涉及一種生產重組高活性錳超氧化物歧化酶的方法。

背景技術

超氧化物歧化酶(superoxide?dismutase，SOD)是一類廣泛存在于生物體內的金屬酶，能夠保護需氧細胞免受正常代謝過程中產生的活性氧(reactive?oxygen?species，ROS)的毒害，其主要催化下列反應：2O₂^.-+2H⁺→H₂O₂+O₂，H₂O₂隨后被過氧化氫酶(CATs)和過氧化物酶清除。

SOD家族有多種同功酶，按分子所含金屬輔基的不同，可將其分為銅鋅超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和胞外超氧化物歧化酶(extracellular?superoxide?dismutase，EC-SOD)四類，這四類SOD都催化同一種催化反應。由于不同類型的SOD在一級結構上無同源性，它們之間的理化特性及穩定性差別很大，不同種屬不同組織來源的同種SOD也略有差別。

錳超氧化物歧化酶(manganese?superoxide?dismutase，Mn-SOD)是哺乳動物的三種超氧化物歧化酶之一，位于線粒體內，對維持胞內ROS平衡具有重要的作用。ROS對多種生理過程的調節具有重要作用，如：信號轉導、凋亡、分化和衰老。ROS不僅和多種病理狀態的病因有關，而且參與腫瘤的形成過程。

Mn-SOD可以從動物血提取，但由于存在動物源性的問題，在應用的過程中可能會存在免疫原性，同時動物源性還可能帶入其它污染，存在不安全問題。所以，利用基因工程技術進行人Mn-SOD的生產是一種可行且便捷的方法。基因工程Mn-SOD的生產存在的問題之一是：由于誘導后的過量表達來不及正確折疊形成不溶性的包涵體，需要進一步的變性、復性才有可能獲得活性Mn-SOD，另外，即使是可溶性表達，也普遍存在活性不高的問題，這也是由于其折疊過程的不正確造成的。

因此，本領域需要進一步研究開發獲得高活性Mn-SOD的方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種生產重組高活性錳超氧化物歧化酶的方法。

在本發明的第一方面，提供一種生產錳超氧化物歧化酶的方法，所述方法包括：

(1)重組表達錳超氧化物歧化酶，獲得含有可溶性表達的錳超氧化物歧化酶的細胞(細胞培養物)；

(2)破碎步驟(1)獲得的細胞，離心獲取上清；

(3)將步驟(2)獲得的上清進行熱變性，熱變性溫度為75±2℃，熱變性時間為10±5分鐘；熱變性后冷卻，離心(優選離心10±2分鐘)獲取上清；

(4)純化步驟(3)得到的上清，獲得純化的錳超氧化物歧化酶；和

(5)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子，獲得激活的錳超氧化物歧化酶。

在一個優選例中，步驟(2)中，采用超聲破碎細胞。

在另一優選例中，步驟(1)中，采用大腸桿菌重組表達錳超氧化物歧化酶。

在另一優選例中，步驟(3)中，熱變性溫度為75±2℃(優選75±1℃，更優選75℃)，熱變性時間為10±2分鐘(優選10±1分鐘；更優選10分鐘)。

在另一優選例中，所述的熱變性在水浴中進行。

在另一優選例中，熱變性后冷卻至0-4℃(優選0℃)。

在另一優選例中，步驟(4)中，采用DEAE-FF陰離子交換樹脂進行純化。

在另一優選例中，所述的錳超氧化物歧化酶是人錳超氧化物歧化酶。

在另一優選例中，步驟(5)中，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶∶錳離子(Mn²⁺)為1∶(5-100)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子。

在另一優選例中，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶∶錳離子為1∶(10-30)在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子。

更優選地，按照摩爾比錳超氧化物歧化酶∶錳離子為1∶20在純化的錳超氧化物歧化酶中加入錳離子。

本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1A、粗酶液的比活與熱變性時間的關系。

圖1B、總的酶活與熱變性時間的關系。

圖2、可溶性表達的rhMn-SOD的純化。

具體實施方式