[發(fā)明專利]活體穿刺技術(shù)檢查蟹類卵巢發(fā)育的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200910054769.0
• 申請(qǐng)日: 2009-07-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101612051A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-12-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉智俊;吳旭干;成永旭;楊筱珍;李光霞;豐浪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): A61B10/00
• 分類號(hào): A61B10/00
• 代理公司: 上海天翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 陳學(xué)雯

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種活體穿刺技術(shù)檢查蟹類卵巢發(fā)育的方法，屬于發(fā)育生物學(xué)和海水養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

自20世紀(jì)80年代以來(lái)，經(jīng)濟(jì)蟹類(中華絨螯蟹、鋸緣青蟹、遠(yuǎn)海梭子蟹和三疣梭子蟹等)養(yǎng)殖在我國(guó)迅速發(fā)展，據(jù)統(tǒng)計(jì)2007年全國(guó)蟹類養(yǎng)殖總產(chǎn)量近70萬(wàn)噸，我國(guó)的蟹類養(yǎng)殖已經(jīng)取得舉世矚目的成就。蟹的主要可食部分為肌肉、卵巢和肝胰腺，其中卵巢具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此在蟹類養(yǎng)殖生產(chǎn)中，卵巢發(fā)育良好的雌蟹，俗稱紅膏蟹，經(jīng)濟(jì)價(jià)值比卵巢發(fā)育差的雌蟹要高很多。另一方面，雌蟹卵巢發(fā)育的好壞直接影響著雌蟹的生殖能力，在蟹類育苗中需要挑選卵巢發(fā)育良好的雌蟹作為親本，這對(duì)于蟹類育苗生產(chǎn)顯得十分重要。此外，研究蟹類卵巢發(fā)育一直是甲殼動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)上的一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容。因此，判斷蟹類卵巢發(fā)育情況對(duì)于了解其發(fā)育生物學(xué)、育苗、養(yǎng)殖和商品蟹流通均具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

對(duì)蝦類的卵巢位于半透明的頭胸甲內(nèi)，通常通過(guò)肉眼即可觀察甲殼內(nèi)的卵巢發(fā)育情況，蟹類的卵巢位于不透明的頭胸甲內(nèi)，故肉眼難以觀察。經(jīng)驗(yàn)的判斷方法是，在一定光照條件下觀察蟹的卵巢是否充滿頭胸甲，如果卵巢充滿頭胸甲，則說(shuō)明卵巢發(fā)育較成熟，但是這種方法的準(zhǔn)確性較差，且不可對(duì)卵巢組織取樣進(jìn)行深入的研究。

判斷卵巢發(fā)育情況較為可靠的方法是解剖雌蟹，取出卵巢觀察發(fā)育情況，但這樣就必須殺死雌蟹，故這種方法在育苗生產(chǎn)和商品蟹銷售過(guò)程中并不可取。我們先前的技術(shù)“采用微型電鉆鉆孔，然后用鑷子活體直接取出少量組織，最后密封穿刺孔”，那種取樣方法對(duì)主要適用于卵巢發(fā)育成熟(五期)的蟹，而且對(duì)蟹的傷害較大，容易產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，例如停食和躁動(dòng)等，從而導(dǎo)致蟹體內(nèi)發(fā)生一系列生理變化(如血糖和雌二醇等含量升高)，甚至造成蟹的應(yīng)激死亡。由于那種采樣方法會(huì)導(dǎo)致卵巢發(fā)育至三期的雌蟹卵巢停止發(fā)育，因此那種方法僅適合于檢查卵巢發(fā)育成熟或者接近成熟的雌蟹，了解其卵巢發(fā)育情況，從而預(yù)報(bào)其產(chǎn)卵期，不適合于研究卵巢發(fā)育早期(四期之前)的蟹。本發(fā)明通過(guò)使用穿刺技術(shù)較好的解決了這一問(wèn)題，能夠精確取樣卵巢發(fā)育早期(三期)的卵巢組織，而且對(duì)蟹的傷害小，不會(huì)影響蟹的卵巢進(jìn)一步發(fā)育，所取的卵巢組織可以用于多種生物學(xué)研究，如組織學(xué)、激素測(cè)定、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等。

此外，在以往的科研工作中，為了計(jì)算蟹的卵巢指數(shù)，首先需要稱重蟹的體重，然后處死蟹，再解剖取出所有卵巢組織，最后稱重卵巢，根據(jù)這些來(lái)計(jì)算卵巢指數(shù)(％)＝100×卵巢重量/雌蟹體重。由于親本蟹價(jià)格昂貴，顯然處死親本蟹的方法不僅增加了科研成本，而且也無(wú)法滿足對(duì)同一個(gè)體不同卵巢發(fā)育階段進(jìn)行連續(xù)采樣的需要，同時(shí)還不利于動(dòng)物福利的開(kāi)展。

以往解剖蟹對(duì)卵巢組織進(jìn)行取樣步驟繁瑣，操作過(guò)程耗時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)于提取RNA等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)不利，稍有不慎便會(huì)使RNA降解，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。同時(shí)解剖過(guò)程中，蟹的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致蟹體內(nèi)生理指標(biāo)的產(chǎn)生變化，對(duì)于激素測(cè)定結(jié)果會(huì)造成較大不良影響。而采用穿刺技術(shù)對(duì)蟹卵巢組織進(jìn)行采樣，不僅操作簡(jiǎn)便和迅速，而且對(duì)蟹傷害小，能避免這些不良影響。

遠(yuǎn)海梭子蟹(Portunus?pelagicus)又稱遠(yuǎn)洋梭子蟹，屬于暖水性蟹類，主要分布在我國(guó)福建、臺(tái)灣、廣東和廣西海域，該蟹最大個(gè)體達(dá)187mm，可食用部分大、營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種優(yōu)質(zhì)的經(jīng)濟(jì)蟹類；另一方面，該蟹生長(zhǎng)迅速、繁殖能力強(qiáng)、抗病能力強(qiáng)、卵巢發(fā)育周期短、在適宜條件下可以全年連續(xù)產(chǎn)卵，所以該蟹具有廣闊的養(yǎng)殖前景，同時(shí)又可以作為研究蟹類卵巢發(fā)育的模式動(dòng)物。因此，本實(shí)驗(yàn)室利用遠(yuǎn)海梭子蟹作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，建立了活體穿刺技術(shù)檢查蟹類卵巢發(fā)育的方法，且通過(guò)實(shí)踐驗(yàn)證了其可行性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明采用活體穿刺技術(shù)在活蟹體內(nèi)取出少量卵巢組織，然后用小塑料板和502膠迅速封住穿刺留下的穿刺孔，這樣極大減少了采樣對(duì)于蟹造成的傷害，能保證采樣后蟹卵巢正常發(fā)育。本方法克服了“采用微型電鉆鉆孔，然后用鑷子活體直接取樣”容易造成“對(duì)蟹的的傷害大，造成較強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)，僅是適合于研究卵巢發(fā)育晚期的蟹”等缺陷。活體穿刺技術(shù)取樣不僅對(duì)蟹的傷害小，而且可以取樣發(fā)育早期的卵巢組織，也可以對(duì)同一個(gè)體進(jìn)行連續(xù)采樣等。該方法簡(jiǎn)單易行，適合于科研和生產(chǎn)單位使用，在活體條件下了解親本的卵巢發(fā)育情況，以及分析卵巢發(fā)育不同時(shí)期激素含量，抽提DNA和RNA等對(duì)樣品進(jìn)行分子生物學(xué)研究。該技術(shù)適用于遠(yuǎn)海梭子蟹、三疣梭子蟹、中華絨螯蟹和鋸緣青蟹等蟹類。