[發明專利]一種檢驗和計數活體微生物的方法

有效

• 申請號: 200910054112.4
• 申請日: 2009-06-30
• 公開（公告）號: CN101935688A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 張紅發;郭本恒;王蔭榆;舒妹
• 申請（專利權）人: 光明乳業股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 薛琦;朱水平

1.一種檢驗和計數活體微生物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)對待檢樣品進行活菌培養計數，初步篩選出陽性可疑微生物；

2)隨機挑取步驟1)所述的陽性可疑微生物，提取基因組DNA，用目標微生物的特異性引物進行PCR檢測并計數。

2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的進行活菌培養計數的方法是平板計數法或最大可能數法。

3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的待檢樣品是可溶性固體、液體樣品，不溶性固體、半固體或粘稠性液體樣品。

4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1)所述的初步篩選出陽性可疑微生物的方法是根據目標微生物的肉眼外觀形態特點，初步區分目標微生物，標記為陽性可疑微生物；或者是針對目標微生物的特異代謝產物加入化學顯色試劑初步區分目標微生物，標記為陽性可疑微生物。

5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的陽性可疑微生物的挑取方法是用無菌槍頭吸取。

6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的提取基因組DNA的方法包括以下步驟：用滅菌槍頭吸取微生物體，將微生物體懸浮于抽提試劑中，80～100℃水浴2～30分鐘；所述的抽提試劑是：0.1～5×PCR緩沖液，0.002～0.2mol/L氫氧化鈉溶液。

7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的目標微生物的特異性引物是在微生物種、屬或菌株水平特異性擴增基因序列的引物。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的目標微生物為長雙歧桿菌，所述的目標微生物的特異性引物是一引物對，包括上游引物和下游引物，上游引物的序列是5’-CCA?TCA?TCC?GCT?TTC?G-3’，見序列表中SEQID?NO.1所示；下游引物的序列是5’-TGG?CAG?ACA?GGA?CCG?ATG-3’，見序列表中SEQ?ID?NO.2所示。

9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)中，同時在平板空白處吸取培養基作為陰性空白對照，監測PCR污染；以目標微生物體懸浮液作陽性對照，監測PCR試劑的有效性；同時利用能夠特異性擴增培養平板上生長出的所有微生物的通用引物作為PCR檢測的陽性標志。

10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述的目標微生物包括細菌、真菌、病毒、放線菌、藻類、螺旋體、支原體、立克次氏體、衣原體、原生動物或亞病毒。

11.一引物對，包括上游引物和下游引物，上游引物的序列是5’-CCATCA?TCC?GCT?TTC?G-3’，見序列表中SEQ?ID?NO.1所示；下游引物的序列是5’-TGG?CAG?ACA?GGA?CCG?ATG-3’，見序列表中SEQ?ID?NO.2所示。