[發明專利]一種檢驗和計數活體微生物的方法

有效

• 申請號: 200910054112.4
• 申請日: 2009-06-30
• 公開（公告）號: CN101935688A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 張紅發;郭本恒;王蔭榆;舒妹
• 申請（專利權）人: 光明乳業股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 薛琦;朱水平

技術領域

本發明屬于食品微生物檢測領域，特別涉及一種檢驗和計數活體微生物的方法。

背景技術

食品生產中經常要檢測樣品中特定微生物的活體數，不同食品要求檢測的微生物種類、數量不同，在各個國家都有相關規定。一般要求產品中益生菌活菌數達到1×10⁶cfu/g，危害微生物要求不能高于規定值產品才能合格，產品中微生物活體數直接影響著產品的質量。

我國目前常用的微生物活體計數方法(如：GB/T4789134-2003和GB/T4789135-2003分別對雙歧桿菌和乳酸菌檢測計數)包括平板計數法和最大可能數(MPN)法(也稱稀釋培養計數)。平板計數法包括倒平板法和涂布法。最大可能數法是一般細菌、病毒及噬菌體的主要計數方法之一。對未知微生物樣品做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取3毫升試樣，接種1毫升到3組共9只裝培養液的試管中，經培養后記錄每個稀釋度出現生長的試管數，培養陽性試管再做鑒定，然后查最大可能數表MPN(most?probably?number)得出待測樣品的含微生物最大可能數，根據樣品稀釋倍數計算出微生物活體數量。MPN法從規定的反應呈陽性管數的出現率，用概率論來推算樣品中菌數最近似的數值。該法常用于食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。利用平板計數法和最大可能數法計數的微生物在培養計數中是未被鑒別的，需要做種類鑒定。

傳統的微生物鑒定主要依據微生物形態、生化鑒定與血清分型。微生物形態鑒定主要是顯微鏡鏡檢，但特異性差，且有些微生物形態多變(如雙歧桿菌)，若檢測微生物與干擾微生物形態相近更難以準確鑒定判斷。生化鑒定得先分離純化微生物得到單克隆，需時1-3天，最后做生化鑒定需至少1-3天，耗時費力；一些難以培養的微生物鑒定就更困難。血清分型鑒定試劑研發周期長，技術要求高，前期投入較多。總之傳統微生物計數法特異性不強、費時費力，特別是樣品中干擾微生物與目標檢測微生物相似時根本無法準確計數。

PCR技術具有快速、靈敏、特異性強的特點。隨著基因技術和網絡信息技術的發展，一般細菌的基因序列在網上都可以免費方便地查到；國內微生物基因測序公司也有很多，測序結果也很準確、方便、便宜，設計微生物種、屬甚至菌株特異性PCR引物變得容易、經濟。PCR本身不可以準確計數，最多可以半定量；但隨著PCR技術的發展，定量PCR也可以計數，但定量PCR難以區分樣品中微生物的死活，且計數結果常有1-2個數量級的誤差。

一些文獻有同時應用微生物計數和PCR技術的報道，如：

《用平板計數和聚合酶鏈反應法檢測湖水中大腸桿菌基因工程菌的穩定性》(張松樂，陳梅玲，張朝隆等.衛生研究，1998，增刊27：152-154.)論文中，將樣品稀釋，同時用平板計數和PCR檢測，只是利用PCR半定量計數的特點對照二種方法的檢測靈敏度，沒有把PCR技術和平板計數技術結合起來。

《X-Gal培養基+PCR法快速鑒定酸奶中雙歧桿菌》(江曉，陳曉蔚，曾理等.現代預防醫學，2005，32(12)：1629-1630)論文中，采用X-Gal培養基對雙歧桿菌標準菌和酸奶中雙歧桿菌進行鑒別，而后通過PCR證實該培養基是一種良好的雙歧桿菌鑒別培養基，可用于雙歧桿菌快速計數。該文中只是用PCR驗證一種選擇培養計數雙歧桿菌方法的可靠性，菌體基因組DNA提取方法需要先純培養再用試劑抽提，操作時間長步驟復雜，實際應用困難。

《利用PCR技術檢測致病性臘樣芽孢桿菌的研究》(王振國，劉金華，肖成蕊等.生物技術.2005，15(5)：45-47)論文中，將待測樣品做梯度稀釋再做PCR檢測，無法區分樣品中死菌和活菌。

專利《計數并鑒別微生物的方法》(CN200510069677.1)公開的一種計數微生物的方法，它是通過濾膜截留微生物，適合可溶性固體、液體樣品中微生物計數，但不適合不溶性固體、半固體、粘稠性液體的計數，且無法區分樣品中的死菌和活菌。該方法難以與現有國標規定的檢測方法對應起來，且沒有解決菌體DNA抽提問題。

由此可見，上述文獻都沒有真正把PCR技術應用到樣品微生物活體計數方法上。

發明內容

因此，本發明要解決的技術問題就是針對傳統的活體微生物檢驗和計數方法的特異性差以及鑒定費時費力的缺陷，提供一種新的檢驗和計數活體微生物的方法，該方法操作簡單，鑒定過程需時短，特異性強，結果準確可靠。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案是：一種檢驗和計數活體微生物的方法，包括以下步驟：