[發明專利]一種CHO細胞中重組糖蛋白高水平表達的載體系統pGN

有效

• 申請號: 200910052576.1
• 申請日: 2009-06-05
• 公開（公告）號: CN101906436A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 盛澤林
• 申請（專利權）人: 蘇州澤璟生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12P21/02
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 徐迅

技術領域

本發明涉及基因工程領域。更具體地，本發明涉及一種CHO細胞中重組糖蛋白高水平表達的載體系統pGN。本發明還提供了特別適合在動物細胞中高效表達IFNβ的表達載體。

背景技術

目前已發展了多種蛋白質表達系統來生產生物體的外源蛋白，比如大腸埃希氏菌表達系統，酵母表達系統，高等真核細胞表達系統等，但這些系統仍存在某些有待改進的缺陷。如何應用這些新的表達系統來高效表達所需目的基因，也是本領域中急需摸索和研究的問題。

例如大腸桿菌作為宿主可表達多種蛋白，但是其存在(1)缺少真核生物的蛋白翻譯后的修飾和加工，如剪切、糖基化、形成二硫鍵等；(2)表達的蛋白多形成不溶性包涵體，需要經過復雜的復性才能恢復構象和活性；(3)菌體蛋白較不利于純化等缺點。

而釀酒酵母系統也具有局限性：(1)產量通常較低；(2)表達質粒易于丟失；(3)缺乏強有力的受嚴格調控的啟動子；(4)外源蛋白過度糖基化修飾會嚴重的改變蛋白質的免疫原性、降低活性、縮短滯留時間；(5)分泌效率差，純化困難。

綜上所述，目前人類的糖基化蛋白質在動物細胞中表達存在表達量較低、生產成本高，或在細菌中表達時活性較低的技術難點。因此，本領域迫切需要開發一種在動物細胞中高效表達人類糖基化蛋白(尤其是IFNβ)的方法。

發明內容

本發明的目的就是提供一種在動物細胞中高效表達人類糖基化蛋白(尤其是IFNβ)的方法。

在本發明的第一方面，提供了一種可用于在動物細胞內表達外源蛋白的表達載體，其特征在于，所述的載體含有表達外源蛋白的表達盒，所述的表達盒從5’至3’依次具有以下元件：

(a)第一啟動子，所述的第一啟動子選自：CMV啟動子；

(b)多克隆位點以及任選的位于多克隆位點之中、之前或之后的外源蛋白的編碼序列；

(c)第一polyA序列，所述的第一polyA序列選自：牛生長因子polyA(bovine?growth?factor?hormone?polyA)；

(d)第二啟動子，所述的第二啟動子選自：β-肌動蛋白啟動子、和SV40早期啟動子、；

(e)選擇標記基因，所述的選擇標記基因選自：DHFR基因；和

(f)第二polyA信號序列，所述的第二polyA信號序列選自：SV40?polyA信號序列。

在另一優選例中，第二啟動子是雞的β-肌動蛋白(chicken?β-actin)啟動子。

在另一優選例中，所述的表達載體還含有增強子。

在另一優選例中，所示的表達載體在元件(a)和(b)之間還具有用于mRNA測序的T7啟動子序列。

在另一優選例中，所述的增強子位于外源蛋白的編碼序列的上游。

在另一優選例中，所述的外源蛋白的編碼序列和所述選擇標記基因含有起始密碼子ATG和終止密碼子。

在另一優選例中，所述的外源蛋白選自下組：促紅細胞生成素、粒細胞集落刺激因子、粒-巨噬細胞集落刺激因子、垂體肽激素、絕經期促性腺激素、胰島素樣生長因子(如生長調節素-C)、角化細胞生長因子、神經膠質細胞系產生的神經營養因子、血栓調節蛋白、堿性纖維母細胞生長因子、胰島素、因子VII、因子VIII、生長激素、骨形態形成蛋白-2、血小板產生的生長因子、水蛭素、及它們突變蛋白、片段、可溶性形式、功能性衍生物、融合蛋白。

在另一優選例中，所述的外源蛋白是β干擾素。

在另一優選例中，所述的β干擾素來源于人。

在另一優選例中，所述的β干擾素具有天然序列、變異序列或重組序列。更佳地，所述的β干擾素具有SEQ?ID?NO：1所述的核苷酸序列

在另一優選例中，所述的抗性基因選自：腺苷脫氨酶(ADA)、新霉素(neo)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、潮霉素B磷酸轉移酶(HPH)、胸苷激酶(tk)、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(gpt)、多重耐藥基因(MDR)、鳥氨酸脫羧酶(ODC)和N-(磷酸乙酰)-L-天冬氨酸抗性(CAD)、或嘌呤霉素-乙酰轉移酶(PAC)

在另一優選例中，所述的標記基因是二氫葉酸還原酶基因(DHFR)。

在另一優選例中，所述的標記基因具有SEQ?ID?NO：2所示的核苷酸序列。

在另一優選例中，所述的載體還含有用于在大腸桿菌中擴增載體的復制起點(pUC)、以及用于在大腸桿菌中進行篩選的另一篩選基因。其中，所述的篩選基因、所述的標記基因和所述的編碼外源蛋白的基因各不相同。