[發(fā)明專利]瓜類主要病原菌的多重PCR檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910052369.6
• 申請日: 2009-06-02
• 公開（公告）號: CN101906466A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發(fā)明（設計）人: 王偉;高永洋;王楠;尹丹韓;唐建輝
• 申請（專利權）人: 華東理工大學;上海偉智生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/645;C12R1/77
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 范征

技術領域

本申請涉及生物技術領域，尤其是生物檢測領域。具體而言，本申請涉及瓜類主要病害的多重PCR檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

瓜類枯萎病(Fusarium?oxysporum?f.sp.niveum)、瓜類蔓枯病(Didymella?bryoniae，國內(nèi)報道多為Mycosphaerella?meloni)、瓜類菌核病(Sclerotinia?sclerotiorum(Lib.)deBary)、瓜類炭疽病菌(Colletotrichum?orbiculare)和瓜黑星病(Cladosporiumcucumerinum)是常見的、重要的五種瓜類作為上的病害。這五種病害傳播途徑、發(fā)病初期癥狀和發(fā)病條件相似，都可以通過土壤帶菌進行侵染，土壤、病殘體、流水、風雨均可使病害傳播。一旦病害發(fā)生，就會嚴重減產(chǎn)，甚至絕收。

由于防治每種病害的藥劑有很多差異，所以在發(fā)病初期或在田間土壤中同時鑒定病害的種類，對預測病害的發(fā)生情況、及時采取有效的防治方法控制病原菌傳播，減少瓜農(nóng)損失具有重要意義。利用傳統(tǒng)的病原菌鑒定方法從發(fā)病植物或栽培土壤中分離鑒定病原菌的時間比較長，程序繁瑣，從發(fā)病初期植株的病原菌分離鑒定需要幾天的時間，如這幾天中遇到有利于病害發(fā)生的天氣，那么病害就會迅速擴散，錯過最佳防治時期。

隨著分子生物學的發(fā)展，已有許多分子技術用于植物炭疽病的檢測，多重PCR是在同一PCR反應管中同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行PCR擴增，可用于同時檢測多種病原菌。目前國內(nèi)外利用多重PCR體系檢測植物病害的很少報道，由于這五種病害是瓜類上的非常重要的病害，所以在國內(nèi)已經(jīng)引起重視，但是能夠同時檢測鑒定出瓜類五種主要病害的分子檢測在國內(nèi)外尚未報道，僅有的幾篇文獻報道主要是通過單重PCR檢測，單一的鑒定瓜類炭疽病、枯萎病、蔓枯病、菌核病^[1-4]，但由于這五種病害傳播途徑、發(fā)病癥狀和發(fā)病條件相似，都可以通過土壤帶菌進行侵染，土壤、病殘體、流水、風雨均可使病害傳播，而且在田間經(jīng)常表現(xiàn)為復合侵染，利用單一PCR檢測對多種病害進行系統(tǒng)檢測，工作量大，加大了對病害檢測鑒定的難度，所以多重PCR技術在瓜類病害檢測中的優(yōu)越性就更加明顯。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服上述難題，本發(fā)明的目的是提供一種用于同時檢測瓜類(尤其是西瓜)主要病原菌的檢測試劑盒和檢測方法。

具體而言，本發(fā)明第一方面提供了一種用于特異性檢測樣品中是否存在瓜類主要病原菌的組合物，其特征在于，所述組合物包含至少3對選自以下的引物對：

第一引物對：SEQ?ID?NO：1所述的序列和SEQ?ID?NO：2所示的序列；

第二引物對：SEQ?ID?NO：3所述的序列和SEQ?ID?NO：4所示的序列；

第三引物對：SEQ?ID?NO：5所述的序列和SEQ?ID?NO：6所示的序列；

第四引物對：SEQ?ID?NO：7所述的序列和SEQ?ID?NO：8所示的序列；

第五引物對：SEQ?ID?NO：9所述的序列和SEQ?ID?NO：10所示的序列。

另一方面，本發(fā)明提供了一種用于特異性檢測樣品中是否存在瓜類主要病原菌的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包含PCR反應體系，所述PCR反應體系包含本發(fā)明所述的組合物。

本發(fā)明還有一個方面提供了一種檢測樣品中是否存在瓜類主要病原菌的方法，該方法包括以下步驟，

a)用上述的PCR檢測試劑盒對樣品進行PCR擴增，獲得PCR擴增產(chǎn)物；

b)測定步驟a)獲得的PCR擴增產(chǎn)物的大小，若產(chǎn)物中存在190bp的DNA片段，則表明所述樣品中瓜黑星病菌；若產(chǎn)物中存在327bp的DNA片段，則表明所述樣品中瓜枯萎病菌；若產(chǎn)物中存在442bp的DNA片段，則表明所述樣品中瓜蔓枯病菌；或產(chǎn)物中存在216bp的DNA片段，則表明所述樣品中瓜炭疽病菌；若產(chǎn)物中存在278bp的DNA片段，則表明所述樣品中瓜菌核病菌。

本發(fā)明利用多重PCR技術檢測西瓜上的重要病害，能夠同時檢測出五種瓜類病害，建立了西瓜主要病害的多重PCR檢測技術，不但準確、快速、可靠，而且相對與單重PCR檢測經(jīng)濟簡便，能大大節(jié)約檢測成本，體現(xiàn)了多重PCR的優(yōu)越性。

附圖說明