[發明專利]瓜類主要病原菌的多重PCR檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200910052369.6
• 申請日: 2009-06-02
• 公開（公告）號: CN101906466A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 王偉;高永洋;王楠;尹丹韓;唐建輝
• 申請（專利權）人: 華東理工大學;上海偉智生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/645;C12R1/77
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 范征

1.一種用于特異性檢測樣品中是否存在瓜類主要病原菌的組合物，其特征在于，所述組合物包含至少3對選自以下的引物對：

第一引物對：SEQ?ID?NO：1所述的序列和SEQ?ID?NO：2所示的序列；

第二引物對：SEQ?ID?NO：3所述的序列和SEQ?ID?NO：4所示的序列；

第三引物對：SEQ?ID?NO：5所述的序列和SEQ?ID?NO：6所示的序列；

第四引物對：SEQ?ID?NO：7所述的序列和SEQ?ID?NO：8所示的序列；

第五引物對：SEQ?ID?NO：9所述的序列和SEQ?ID?NO：10所示的序列。

2.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含至少4對選自以下的引物對：

第一引物對：SEQ?ID?NO：1所述的序列和SEQ?ID?NO：2所示的序列；

第二引物對：SEQ?ID?NO：3所述的序列和SEQ?ID?NO：4所示的序列；

第三引物對：SEQ?ID?NO：5所述的序列和SEQ?ID?NO：6所示的序列；

第四引物對：SEQ?ID?NO：7所述的序列和SEQ?ID?NO：8所示的序列；

第五引物對：SEQ?ID?NO：9所述的序列和SEQ?ID?NO：10所示的序列。

3.如權利要求2所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含所述第一引物對，所述第二引物對，所述第三引物對，和所述第五引物對。

4.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含所述第一引物對，所述第二引物對和所述第三引物對；或所述組合物包含所述第二引物對，所述第三引物對和所述第四引物對。

5.如權利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含所述第一引物對，所述第二引物對，所述第三引物對，所述第四引物對和所述第五引物對。

6.一種用于特異性檢測樣品中是否存在瓜類主要病原菌的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包含PCR反應體系，所述PCR反應體系包含權利要求1-5任一項所述的組合物。

7.一種檢測樣品中是否存在瓜類主要病原菌的方法，該方法包括以下步驟，

a)用權利要求6所述的PCR檢測試劑盒對樣品進行PCR擴增，獲得PCR擴增產物；

b)測定步驟a)獲得的PCR擴增產物的大小，若產物中存在190bp的DNA片段，則表明所述樣品中瓜黑星病菌；若產物中存在327bp的DNA片段，則表明所述樣品中瓜枯萎病菌；若產物中存在442bp的DNA片段，則表明所述樣品中瓜蔓枯病菌；或產物中存在216bp的DNA片段，則表明所述樣品中瓜炭疽病菌；若產物中存在278bp的DNA片段，則表明所述樣品中瓜菌核病菌。

8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述樣品是瓜組織或其DNA提取物，所述瓜選自西瓜、甜瓜、黃瓜、冬瓜、瓤瓜、苦瓜、南瓜、西葫蘆和絲瓜。

9.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR反應體系包含所述第一引物對，所述第二引物對，所述第三引物對，所述第四引物對和所述第五引物對；所述PCR的反應體系，以總體積為25μl計，含有ExTaq酶12.5μl，10μM的所述第一引物對引物各0.6μl，10μM的所述第二引物對引物各0.5μl，10μM的所述第三引物對引物各0.7μl，10μM的所述第四引物對引物各0.5μl，10μM的所述第五引物對引物各0.6μl，模板各1μl；所述步驟a)的擴增包括：94℃預變性6分鐘，進入循環，94℃變性30S，42℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，共40個循環，最后72℃延伸10分鐘。

10.如權利要求7所述的方法，所述PCR反應體系包含所述第一引物對，所述第二引物對，所述第三引物對和所述第五引物對；所述PCR的反應體系，以總體積為25μl計，含有ExTaq酶12.5μl，10μM的所述第一引物對引物各0.6μl，10μM的所述第二引物對引物各0.5μl，10μM的所述第三引物對引物各0.7μl，10μM的所述第五引物對引物各0.5μl，模板各1μl；所述步驟a)的擴增包括：94℃預變性6分鐘，進入循環，94℃變性30S，44℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘，共40個循環，最后70℃延伸10分鐘。