[發明專利]瓜黑星病菌的檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200910052368.1
• 申請日: 2009-06-02
• 公開（公告）號: CN101906465A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 王偉;高永洋;王楠;高觀朋;唐建輝
• 申請（專利權）人: 華東理工大學;上海偉智生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12R1/77;C12R1/645
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 范征

技術領域

本申請涉及生物技術領域，尤其是生物檢測領域。具體而言，本申請涉及瓜黑星病菌的檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

瓜瘡痂枝孢霉菌(Cladosporium?cucumerinum，又稱為瓜黑星病菌)能引起黃瓜、西瓜、西葫蘆、南瓜、甜瓜、冬瓜等瓜類病害，以黃瓜上的黑星病發病最為常見[1]。瓜黑星病是瓜上的一種毀滅性病害，由于其危害嚴重，難以防治，我國已將其列為全國植物檢疫性有害生物。瓜類枯萎病菌Fusarium?oxysporum、瓜類蔓枯病菌(Didymellabryoniae，國內報道多為Mycosphaerella?meloni)也是瓜類重要的病原菌，這三種病原菌是瓜類中非常常見的三種病原菌。

黃瓜黑星病在幼苗期、成株期都能感病，病原菌可侵染嫩葉、嫩莖和幼瓜，是瓜類中常見的病害，一旦病害發生，就會嚴重減產，甚至絕收。瓜類枯萎病、瓜類蔓枯病能同時發生，是造成瓜類損失的主要病害。瓜枯萎病，瓜農叫″死藤″，一般在植株開花結果期開始在田間陸續表現出癥狀，自幼苗至成株期均可發病，在開花結果期最重[5]。瓜蔓枯病病原，屬子囊菌亞門真菌，發病主要在瓜類生長中后期，植株蔓、葉、果實均可發病，主要危害葉片和瓜蔓[6]。三種病害在初發期，很難從癥狀上進行鑒定，因此，給及時、有效防治帶來困難。

由于這三種病害傳播途徑、發病癥狀和發病條件相似，都可以通過土壤帶菌進行侵染，土壤、病殘體、流水、風雨均可使病害傳播。在土地連作、田間濕度大、通風不良情況下，病害比較容易發生。這三種病害無論是在保護地還是在露地栽培中發病都比較常見。

因此，本領域中迫切需要能開發出新的檢測方法和試劑盒，以便在發病初期或在田間土壤中同時鑒定多種瓜類主要病害，從而預測病害的發生情況、及時采取有效的防治方法控制病原菌傳播，減少瓜農損失。

發明內容

為實現上述目的，本發明者通過測定瓜黑星病菌(Cladosporium?cucumerinum)rDNA的ITS序列，比對近緣種及瓜類不同致病病原菌的ITS序列同源性，設計出了特異性引物HX-1/HX-2。

因此，本發明第一方面提供了一種用于特異性檢測樣品中瓜黑星病菌的組合物，所述組合包括一對特異性引物，所述特異性引物對的序列分別是SEQ?ID?NO：1和SEQID?NO：2所示的序列。

本發明另一方面提供了一種用于特異性檢測樣品中瓜黑星病菌的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包含PCR反應體系，所述反應體系包含一對特異性引物，所述特異性引物對的序列分別是SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示的序列。

本發明另一方面提供了一種檢測樣品中瓜黑星病菌的方法，該方法包括以下步驟：a)用本發明上述的PCR檢測試劑盒對所述樣品進行PCR擴增，獲得PCR擴增產物；b)測定步驟a)獲得的PCR擴增產物的大小，若產物中存在190bp的DNA片段，則表明所述樣品中瓜黑星病菌。在一個較佳的實施方案中，所述步驟a)的擴增包括在94℃預變性5分鐘；94℃變性45秒，60℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共32個循環，最后72℃延伸7分鐘。在另一較佳的實施方案中，所述瓜選自西瓜、甜瓜、黃瓜、冬瓜、瓤瓜、苦瓜、南瓜、西葫蘆和絲瓜。

本發明另一方面還提供了一種用于同時特異性檢測樣品中瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌和瓜黑星病菌的組合物，所述組合物包括三對特異性引物，其中，第一引物對的序列是SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示的序列，第二引物對的序列是SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4所示的序列，第三引物對的序列是SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：6所示的序列。

本發明另一方面提供了一種用于同時特異性檢測樣品中瓜枯萎病菌、瓜蔓枯病菌和瓜黑星病菌的PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包含PCR反應體系，所述反應體系包含三對特異性引物，其中，第一引物對的序列是SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示的序列，第二引物對的序列是SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4所示的序列，第三引物對的序列是SEQ?ID?NO：5和SEQ?ID?NO：6所示的序列。