[發(fā)明專利]一種篩選菌種的方法及其引物和試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200910050125.4
• 申請日: 2009-04-28
• 公開（公告）號: CN101875964A
• 公開（公告）日: 2010-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張紅發(fā);舒妹;王蔭榆;沈玲
• 申請（專利權(quán)）人: 光明乳業(yè)股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 薛琦;朱水平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于菌種篩選純化領(lǐng)域，特別涉及一種篩選菌種的方法及其引物和試劑盒。

背景技術(shù)

良好的菌種是微生物發(fā)酵工業(yè)的基礎(chǔ)。能夠用于食品的菌種和不同食品的可用菌種，如乳酸菌、雙歧桿菌等，在各個國家都是有相關(guān)規(guī)定的。現(xiàn)在大部分用的菌種都是國外公司壟斷的，且他們篩選的益生菌適合外國人群，但不一定適合中國人群。中國擁有自己專利的菌種數(shù)量少，種類、功能單一。得到功能良好、合適的菌株是食品益生菌領(lǐng)域要解決的主要技術(shù)問題之一。常用的篩選菌種的方法是從自然界的生態(tài)環(huán)境中分離出新菌株。由于微生物到處都有，無孔不入，所以它們在自然界大多是以混雜的形式群居于一起的。自然界工業(yè)菌種分離篩選的主要步驟是：樣品采集，增殖培養(yǎng)、培養(yǎng)分離和篩選鑒定。通過樣品采集和增殖培養(yǎng)后，樣品中的微生物還處于混在生長狀態(tài)，還需要進(jìn)行純種分離。常用的培養(yǎng)分離方法包括稀釋分離法和劃線分離法。待長出獨立的單個菌落，進(jìn)行挑選分離，然后對該菌落進(jìn)行菌種鑒定。鑒定包括菌落形態(tài)、菌落性狀以及菌落的生理生化指標(biāo)鑒定。這些篩選菌種的方法，周期長，工作量大，試劑設(shè)備投資多，效率差。并且，因為篩選具有隨機性，一旦所篩選的樣品中無目標(biāo)菌，則浪費大量人力物力。

發(fā)明內(nèi)容

因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的篩選菌種的方法存在盲目性、速度慢、效率低、工作量大、周期長的缺陷，提供一種新的篩選菌種的方法，該方法快速、高效。本發(fā)明還提供一種篩選菌種的引物及其試劑盒。

本發(fā)明人經(jīng)過廣泛的研究和大量的試驗，發(fā)現(xiàn)隨著基因技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)信息技術(shù)的發(fā)展，一般細(xì)菌的基因序列在網(wǎng)上都可以免費方便地查到，設(shè)計種、屬甚至菌株特異性PCR引物變得很容易，并且也已經(jīng)有許多被公開了。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，利用PCR技術(shù)具有快速、靈敏、特異性強的特點，先用PCR技術(shù)篩選含有目標(biāo)菌的混合菌樣品，可以避免下一步篩選的盲目性，大大提高篩選效率；再用PCR技術(shù)篩選目標(biāo)菌的分離純種菌落，可以大大減少篩選時間，高效的篩選到目標(biāo)菌純種菌落，從而完成了本發(fā)明。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是：一種篩選菌種的方法，包括以下步驟：

1)提取待篩樣品中的基因組DNA，利用目標(biāo)菌特異性的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，選擇有特異性擴(kuò)增的樣品作為含有目標(biāo)菌的進(jìn)一步篩選樣品；

2)將步驟1)所述的含有目標(biāo)菌的進(jìn)一步篩選樣品培養(yǎng)分離，挑選單克隆，提取單克隆的基因組DNA，用目標(biāo)菌特異性的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，選擇有特異性擴(kuò)增的單克隆即為目標(biāo)嫌疑菌；

3)目標(biāo)嫌疑菌進(jìn)行菌種鑒定，確定目標(biāo)菌。

根據(jù)本發(fā)明，步驟1)為提取待篩樣品中的基因組DNA，利用目標(biāo)菌特異性的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，選擇有特異性擴(kuò)增的樣品作為含有目標(biāo)菌的進(jìn)一步篩選樣品。其中，所述的待篩樣品較佳的是動物或人的糞便。所述的目標(biāo)菌可以是任何待篩選的菌類，如可以篩選雙歧桿菌(Bifidobacterium)，釀酒用的酵母菌，或者從自然發(fā)酵酸奶中分離酸奶發(fā)酵菌種(如嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌)等，本發(fā)明優(yōu)選雙歧桿菌為例來說明。所述的目標(biāo)菌特異性的PCR引物較佳的選自特異性擴(kuò)增目標(biāo)菌核糖體(rRNA)基因、或種屬特異性蛋白或酶基因的引物，更佳的是堿基序列如序列表中SEQNO：1或SEQ?NO：2所示的引物。PCR反應(yīng)的條件和程序和本領(lǐng)域常規(guī)相同。通過PCR擴(kuò)增可以大量初篩樣品，甚至可以通過PCR條帶的強弱初步判斷目標(biāo)菌含量的多少，節(jié)約時間、人力和物力。

根據(jù)本發(fā)明，步驟2)為將步驟1)所述的含有目標(biāo)菌的進(jìn)一步篩選樣品培養(yǎng)分離，挑選單克隆，提取單克隆的基因組DNA，用目標(biāo)菌特異性的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，選擇有特異性擴(kuò)增的單克隆即為目標(biāo)嫌疑菌。其中，所述的培養(yǎng)分離的方法可以是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，較佳的為選擇富集培養(yǎng)法、稀釋計數(shù)法、劃線分離法或這些方法的組合。所述的目標(biāo)菌特異性的PCR引物，較佳的和步驟1)中相同，選自特異性擴(kuò)增目標(biāo)菌核糖體小亞基基因、或種屬特異性蛋白或酶基因的引物，更佳的是堿基序列如序列表中SEQ?NO：1或SEQ?NO：2所示的引物。該引物通過PCR可以快速初步篩選到屬水平的雙歧桿菌，對該雙歧桿菌的種水平的鑒定還需要其他的方法進(jìn)一步的鑒定，如生理生化反應(yīng)鑒定法、基因測序法，通過PCR擴(kuò)增，可以快速高效地檢測判斷可疑菌落，大大提高目標(biāo)菌篩選速度和效率。

根據(jù)本發(fā)明，步驟3)為目標(biāo)嫌疑菌進(jìn)行菌種鑒定，確定目標(biāo)菌。其中，所述的菌種鑒定的方法可以是本領(lǐng)域的常規(guī)方法，如生理生化反應(yīng)鑒定法等，較佳的為基因測序鑒定法。根據(jù)各種篩選目的，可以將目標(biāo)嫌疑菌一直鑒定到種或菌株水平。經(jīng)過鑒定的菌株可按本領(lǐng)域常規(guī)方法保存。