[發明專利]一種篩選菌種的方法及其引物和試劑盒

無效

• 申請號: 200910050125.4
• 申請日: 2009-04-28
• 公開（公告）號: CN101875964A
• 公開（公告）日: 2010-11-03
• 發明（設計）人: 張紅發;舒妹;王蔭榆;沈玲
• 申請（專利權）人: 光明乳業股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 薛琦;朱水平

技術領域

本發明屬于菌種篩選純化領域，特別涉及一種篩選菌種的方法及其引物和試劑盒。

背景技術

良好的菌種是微生物發酵工業的基礎。能夠用于食品的菌種和不同食品的可用菌種，如乳酸菌、雙歧桿菌等，在各個國家都是有相關規定的。現在大部分用的菌種都是國外公司壟斷的，且他們篩選的益生菌適合外國人群，但不一定適合中國人群。中國擁有自己專利的菌種數量少，種類、功能單一。得到功能良好、合適的菌株是食品益生菌領域要解決的主要技術問題之一。常用的篩選菌種的方法是從自然界的生態環境中分離出新菌株。由于微生物到處都有，無孔不入，所以它們在自然界大多是以混雜的形式群居于一起的。自然界工業菌種分離篩選的主要步驟是：樣品采集，增殖培養、培養分離和篩選鑒定。通過樣品采集和增殖培養后，樣品中的微生物還處于混在生長狀態，還需要進行純種分離。常用的培養分離方法包括稀釋分離法和劃線分離法。待長出獨立的單個菌落，進行挑選分離，然后對該菌落進行菌種鑒定。鑒定包括菌落形態、菌落性狀以及菌落的生理生化指標鑒定。這些篩選菌種的方法，周期長，工作量大，試劑設備投資多，效率差。并且，因為篩選具有隨機性，一旦所篩選的樣品中無目標菌，則浪費大量人力物力。

發明內容

因此，本發明要解決的技術問題就是針對現有的篩選菌種的方法存在盲目性、速度慢、效率低、工作量大、周期長的缺陷，提供一種新的篩選菌種的方法，該方法快速、高效。本發明還提供一種篩選菌種的引物及其試劑盒。

本發明人經過廣泛的研究和大量的試驗，發現隨著基因技術和網絡信息技術的發展，一般細菌的基因序列在網上都可以免費方便地查到，設計種、屬甚至菌株特異性PCR引物變得很容易，并且也已經有許多被公開了。本發明人發現，利用PCR技術具有快速、靈敏、特異性強的特點，先用PCR技術篩選含有目標菌的混合菌樣品，可以避免下一步篩選的盲目性，大大提高篩選效率；再用PCR技術篩選目標菌的分離純種菌落，可以大大減少篩選時間，高效的篩選到目標菌純種菌落，從而完成了本發明。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之一是：一種篩選菌種的方法，包括以下步驟：

1)提取待篩樣品中的基因組DNA，利用目標菌特異性的PCR引物進行PCR反應，選擇有特異性擴增的樣品作為含有目標菌的進一步篩選樣品；

2)將步驟1)所述的含有目標菌的進一步篩選樣品培養分離，挑選單克隆，提取單克隆的基因組DNA，用目標菌特異性的PCR引物進行PCR反應，選擇有特異性擴增的單克隆即為目標嫌疑菌；

3)目標嫌疑菌進行菌種鑒定，確定目標菌。

根據本發明，步驟1)為提取待篩樣品中的基因組DNA，利用目標菌特異性的PCR引物進行PCR反應，選擇有特異性擴增的樣品作為含有目標菌的進一步篩選樣品。其中，所述的待篩樣品較佳的是動物或人的糞便。所述的目標菌可以是任何待篩選的菌類，如可以篩選雙歧桿菌(Bifidobacterium)，釀酒用的酵母菌，或者從自然發酵酸奶中分離酸奶發酵菌種(如嗜熱鏈球菌、德氏乳桿菌保加利亞乳桿菌)等，本發明優選雙歧桿菌為例來說明。所述的目標菌特異性的PCR引物較佳的選自特異性擴增目標菌核糖體(rRNA)基因、或種屬特異性蛋白或酶基因的引物，更佳的是堿基序列如序列表中SEQNO：1或SEQ?NO：2所示的引物。PCR反應的條件和程序和本領域常規相同。通過PCR擴增可以大量初篩樣品，甚至可以通過PCR條帶的強弱初步判斷目標菌含量的多少，節約時間、人力和物力。

根據本發明，步驟2)為將步驟1)所述的含有目標菌的進一步篩選樣品培養分離，挑選單克隆，提取單克隆的基因組DNA，用目標菌特異性的PCR引物進行PCR反應，選擇有特異性擴增的單克隆即為目標嫌疑菌。其中，所述的培養分離的方法可以是本領域的常規方法，較佳的為選擇富集培養法、稀釋計數法、劃線分離法或這些方法的組合。所述的目標菌特異性的PCR引物，較佳的和步驟1)中相同，選自特異性擴增目標菌核糖體小亞基基因、或種屬特異性蛋白或酶基因的引物，更佳的是堿基序列如序列表中SEQ?NO：1或SEQ?NO：2所示的引物。該引物通過PCR可以快速初步篩選到屬水平的雙歧桿菌，對該雙歧桿菌的種水平的鑒定還需要其他的方法進一步的鑒定，如生理生化反應鑒定法、基因測序法，通過PCR擴增，可以快速高效地檢測判斷可疑菌落，大大提高目標菌篩選速度和效率。

根據本發明，步驟3)為目標嫌疑菌進行菌種鑒定，確定目標菌。其中，所述的菌種鑒定的方法可以是本領域的常規方法，如生理生化反應鑒定法等，較佳的為基因測序鑒定法。根據各種篩選目的，可以將目標嫌疑菌一直鑒定到種或菌株水平。經過鑒定的菌株可按本領域常規方法保存。